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一、开机前的准备工作 1.流动相的更换和过滤 (1)检查流动相是否太少或放置太久。A通道，放置水相（超纯水），B通道放置有机相（国产甲醇，进口乙腈）。 (2)混合流动相的过滤原则：纯有机相或含一定比例有机相的就要用有机系0.45μm的滤膜，水相或缓冲盐的就要用水系0.45μm滤膜。这一点需特别注意,因有机溶剂可以溶解水系滤膜,被溶解的水系滤膜更易损坏密封圈和柱塞杆。 (3)流动相的超声脱气 2.更换泵头清洗瓶中溶液 属于后密封自动冲洗，一小时清洗五分钟。 清洗液为5%-10%的甲醇或异丙醇的水溶液，所使用的试剂必须为色谱纯，用超纯水或二次蒸馏水来配置。 3. 清洗定量环 首先将手动进样阀的扳手反时针扳至 “Load”状态，用医用注射器吸入约1～2 ml的50%的甲醇或异丙醇后，接上7725阀专用接头（白色），从手动进样阀的进样口注入，进行手动进样阀的清洗；然后将手动进样阀的扳手顺时针扳至 “Inject”状态，以同样的方法清洗；反复三次。使用前再用当天使用的流动相按上述操作清洗。 4.废液瓶是否已满或能否达到本次实验所要求的废液量 二、仪器开机 1.打开仪器电源开关（自上而下）仪器将开机自动进行自检。各部分自检成功后，方可正常进行以下各步操作。 2.打开电脑，等待约1—2分钟，Chromeleon license server monitor将会自动启动，查看是否处于has active状态；双击电脑右下角的变色龙软件的服务监测器（Chromeleon server monitor），左键单击“启动”按钮激活监视器，待显示处于idle（空闲）状态且显示软件的系列号后，表明监视器已经启动。 3.双击电脑桌面的“变色龙Chromeleon”图标。类似windows操作系统中的资源管理器，左方为根目录，右方为该目录下的文件夹或文件。 双击右方框下方中的“U3000仪器控制面板.pts”，或点击工具栏中“查看”下方的“默认面板Tabset” 弹出如下所示界面。 4. 排系统气泡 先向上掀开泵头前面板，然后拧松快速清洗阀（反时针两圈左右）（拧得过松流动相容易从清洗阀部位流进泵头中引起报警）。 然后在软件中点击“冲洗”键，泵将以4.0 ml/min的速度自动快速清洗泵内残留的气泡，5分钟将自动停止。若想手动停止，只要再按“冲洗”键，将停止清洗。清洗完毕，先停泵，再拧紧快速清洗阀。切记：不要在泵未停止清洗前拧紧快速清洗阀。 *使用快速清洗阀时，只能逐个通道的排气泡，要使用的每个通道（A/B/C/D）都需要设100%A，B，C，D单独快速清洗来排气泡。不要通过分别设定每个通道的比例让多通道进行同时快速清洗，这样容易损坏比例阀。 *清洗有缓冲盐的那个通道前后，一定要用去离子水清洗管路和泵头。以防止缓冲盐直接与纯的有机相（甲醇、乙腈等）混合而产生结晶堵塞比例阀。 三、仪器及系统平衡 1.设置好泵的流速/压力，eluent（淋洗液）后，点击“motor on”（泵和比例阀的开关） 2.点亮紫外检测器的UV-Lamp，在开泵稳定5分钟以后再开紫外检测器的灯。 3.在方法要求使用柱温箱时，应将温度设置到预定值并将温控temperature control 设为“on” 4.手动进样阀在系统平衡过程中应扳至inject位置，以保证 系统充分平衡。 5.点工具栏中蓝色小圆点“acquisition on/off”，开始设置采集基线：选择UV，设置好检测通道及波长后，设定完成后,按“确定”键，便可进行基线的采集。 6. 系统平衡步骤 (1)分析样品前先用甲醇或乙腈冲洗流路约20分钟，平衡活化色谱柱，并赶走管路中的杂质和水分。 (2)若流动相为有机相与水相的混合物，则第1步完成后，按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。 (3)若流相相中含有缓冲盐溶液、有机/无机酸或其它电解质，则第1步完成后用95%左右的去离子水冲洗流路约20分钟后，再按照分析样品的需要调节比例阀的比例后冲洗流路约30分钟后，待基线走平后即可进样。 四、样品表的建立 1．新建一个程序文件 1.1依次点击File/New，选中“Program File”后，进入程序编辑向导界面。 1.2确认泵的工作方式（“Isocratic”等度分析、“Ramp”一步梯度分析和“Multi-Step Gradient”多步梯度分析）、合适的流动相通道及高/低压极限和流速。 1.3通道的选择，设定采集一个样时需要采集的时间段（Acquisition Time），也可以不从0分钟开始采集，也就是前一段时间不采集信号。 1.4检测器信号的具体设置，设定检测波长，波长带宽，参比波长，参比波长带宽。 2．新建一个方法文件File/New，选中“Method File”后，