柑橘全爪螨微卫星位点鉴定与信息分析.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(2):282-293 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.02.009 柑橘全爪螨微卫星位点鉴定与信息分析 魏丹丹，刘 燕，杜 洋，李 刚，李 婷，袁明龙，王进军 （西南大学植物保护学院，重庆400715 ） 摘要：【目的】通过磁珠富集法构建柑橘全爪螨（Panonychus citri ）微卫星富集文库，发掘柑橘全爪螨 基因组微卫星（gSSR）序列。同时，利用柑橘全爪螨转录组数据库，筛选其功能微卫星（EST-SSR）分子标记， 设计柑橘全爪螨微卫星（SSR）引物并验证其适用性。【方法】在提取柑橘全爪螨高质量基因组 DNA 的基础上， 使用链霉亲和素偶联的磁珠与生物素标记的微卫星探针结合，亲和性捕捉由限制性内切酶酶切产生的含 SSR 的单链基因组 DNA 目的序列，经 PCR 扩增为双链后，克隆并构建 SSR 富集文库，测序筛选 SSR 序列。另一方面， 基于柑橘全爪螨转录组数据，利用 msatcommander 软件发掘其功能微卫星标记。采用 Primer Premier 5 软件 设计 SSR 引物，并进行验证。【结果】构建了柑橘全爪螨 AC、TC 和 ATG 共 3 个 SSR 富集文库，阳性克隆率分别 约为 30%、28%和 25%。对文库的测序结果表明，AC 文库的冗余率最高，TC 文库次之，而 ATG 文库未发现相同 微卫星位点的克隆。同时，在 AC 文库中，大部分 AC 重复类型的 SSR 为多拷贝微卫星位点，其中有相当一部分 SSR 的一侧侧翼序列完全相同或高度相似。从 3 个 SSR 富集文库中获得了可用于设计引物的 gSSR 单一序列 44 条（GenBank 登录号为 JF776418—JF776461），共合成了 20 对 SSR 引物，其中能够稳定扩增的引物有 11 对。 柑橘全爪螨 gSSR 中完美型 SSR 占 54.5%，非完美型和复合型 SSR 分别占 27.3%和 18.2%。在完美型的 gSSR 中， 两碱基重复 SSR 的核心重复次数（13—42 次）大于三碱基重复 SSR（5—9 次）。从柑橘全爪螨转录组数据库中 共获得 8 023 个 EST-SSR 位点，其中 2 540 个 SSR 可用于引物设计，共合成了 35 对引物（GenBank 登录号为 KT261306—KT261340），其中能够稳定扩增的引物有 8 对。柑橘全爪螨 EST-SSR 的平均分布频率为 1/3.55 kb。 其中，三碱基为优势核心重复类型，占总数的 53.86%；其次为两碱基核心重复类型，占总数的 43.36%；而四、 五、六碱基重复类型以及复合型的 SSR 数量均较少，且数量差异不大，共占 EST-SSR 总数的 2.78%。柑橘全爪 螨 EST-SSR 核心重复次数主要集中在 5—10 次。【结论】采用磁珠富集法，并将酶切、接头连接一步化，可提 高个体微小的螨类及微小昆虫 SSR 的富集效率。柑橘全爪螨 gSSR 核心重复次数要远多于从转录组数据库获得 的 EST-SSR。总体而言，gSSR 和 EST-SSR 中的三碱基重复 SSR 具有更好的优化率。此外，柑橘全爪螨 gSSR 具 有微卫星家族现象。 关键词：柑橘全爪螨；叶螨科；高通量测序；分子标记；微卫星富集文库 Analysis of Microsatellite Loci from Panonychus citri Based on Enriched Microsatellite Library and Transcriptome Dataset WEI Dan-dan, LIU Yan, DU Yang, LI Gang, LI Ting, YUAN Ming-long, WANG Jin-jun (College of Plant Protection, Southwest University, Chongqing 400715) Abstract: 【Ob