甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV）荧光定量RT-PCR检测方法的建立.pdfVIP

中国农业科学 2016,49(1):90-102 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2016.01.008 甘薯羽状斑驳病毒（SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（SPCSV） 荧光定量RT-PCR检测方法的建立 卢会翔，吕长文，吴正丹，罗 凯，尹 旺，杨 航，王季春，张 凯 （西南大学农学与生物科技学院，重庆 400716 ） 摘要：【目的】甘薯病毒病（sweet potato virus disease, SPVD）是甘薯上的毁灭性病害之一，严重时可 造成90%以上的产量损失。论文旨在对甘薯SPVD染病植株中甘薯羽状斑驳病毒（Sweet potato feathery mottle virus，SPFMV）和甘薯褪绿矮化病毒（Sweet potato chlorotic stunt virus, SPCSV）2种病毒的复合侵染情况 进行研究，建立SPVD荧光定量RT-PCR快速检测方法，为SPVD的早期预警和流行学研究提供技术手段。【方法】 选 取重庆地区具有不同 SPVD 典型症状的甘薯品种（系）叶片作为试验材料，对其进行症状和 SPFMV、SPCSV 的硝酸 纤维素膜酶联免疫吸附（NCM-ELISA）检测；对供试材料叶片中的 SPFMV 外壳蛋白 CP 和 SPCSV 热激蛋白 HSP70 核 苷酸序列进行克隆和序列分析，根据保守核苷酸序列设计荧光定量 RT-PCR 检测引物。以甘薯泛素（ubiquitin， UBI ）和组蛋白（histone，H2B ）编码基因为内参对供试样品进行荧光定量RT-PCR检测，与感染SPVD 典型症状和 NCM-ELISA 检测结果进行比较，并对取自不同甘薯品种(系)、相同品种(系)不同单株以及相同植株不同部位叶片 检测结果进行比较，筛选可快速、精确、定量检测SPVD 的荧光定量RT-PCR检测方法。【结果】症状学诊断表明不 同甘薯品种（系）的感病叶片可能表现出不同的典型症状特点，同一品种（系）的不同感病植株感病症状相似但 也存在差异。序列分析结果表明供试材料中SPFMV至少存在2个株系类型(RC和EA)，SPCSV至少存在1个株系类 型（WA）。在15份供试材料中，10份材料由 NCM-ELISA和荧光定量RT-PCR 均检测到SPFMV和SPCSV的共同感染， 且荧光定量 RT-PCR 检测结果与发病症状和 NCM-ELISA 检测结果相吻合，其检测结果可准确反映甘薯 SPVD 染病植 株中 2 种病毒复合侵染情况。荧光定量 RT-PCR 检测结果还表明，不同品种(系)或相同品种(系)不同单株病叶中 SPFMV CP 与SPCSV HSP70 转录水平存在差异；相同植株顶端幼嫩叶片和中部成熟叶片中SPFMV CP 与 SPCSV HSP70 转录水平也存在差异。染病材料中SPFMV 中 CP 转录水平均相对较高，是SPCSV的 HSP70 转录水平的 3—556倍。4 份材料经NCM-ELISA检测只有SPFMV而没有SPCSV感染，而荧光定量RT-PCR还可检测到其中2份材料中SPCSV HSP70 转录水平，说明这2份材料中也存在SPFMV 和SPCSV的共同感染，表明荧光定量RT-PCR 比NCM-ELISA 检测结果更 灵敏、准确。【结论】 筛选出可利用 SPFMV CP 与 SPCSV HSP70 转录水平进行检测的荧光定量 RT-PCR 检测引物， 建立了SPVD荧光定量RT-PCR 快速检测方法，为SPVD针对性地监测预警提供了极为有效的方法。在建立甘薯SPVD 防御体系时，需综合考虑2 种甘薯病毒的共侵染特性和甘薯品种差异，采取针对性的监测和预警机制。 关键词：甘薯羽状斑驳病毒；甘薯褪绿矮化病毒；甘薯病毒病；荧光定量RT-PCR；NCM-ELISA Development of Detecti