甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(23):4627-4636 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.23.008 甘蔗黄叶病毒P0蛋白分子特性及其抑制RNA沉默活性 1 1 1 1 1 1 1,2 林艺华 ，肖胜华 ，刘营航 ，陈建生 ，傅华英 ，陈如凯 ，高三基 1 2 （福建农林大学农业部福建甘蔗生物学与遗传育种重点实验室，福州 350002 ； 广西大学广西蔗糖产业协同创新中心，南宁 530004 ） 摘要：【目的】甘蔗黄叶病（yellow leaf，YL）是一种主要的甘蔗病毒病害，在全球多数甘蔗种植国家或地 区普遍发生，已对甘蔗生产造成严重威胁。其病原为甘蔗黄叶病毒（Sugarcane yellow leaf virus，SCYLV），属 于黄症病毒科马铃薯卷叶病毒属成员。研究SCYLV编码的沉默抑制子P0蛋白的分子特征、保守结构域及其在自然 寄主甘蔗上抑制RNA沉默的功能，为下一步从RNA沉默水平解析SCYLV致病分子机理奠定基础。【方法】利用RT-PCR 克隆技术获得SCYLV中国分离物CHN-FJ4编码的RNA沉默抑制子基因 P0 及其两个缺失突变体 P0Δ2-15 （N端缺失15 个氨基酸）和 P0Δ155-256 （C 端缺失 102 个氨基酸），然后定向克隆到单子叶植物表达载体 pUbi-nos（空载体）上， 获得重组质粒。利用甘蔗嫩叶组织瞬时表达系统鉴定病毒 RNA 沉默抑制子技术，结合 ImageJ 软件定量分析 P0 及 其两个缺失突变体抑制外源基因 EYFP 瞬时表达活性的变化。番茄丛矮病毒（Tomato bushy stunt virus，TBSV） 编码的 P19 作为沉默抑制子阳性对照。【结果】P0 核苷酸序列的遗传进化分析结果显示，所获得的 SCYLV 病毒分 离物 CHN-FJ4 为 BRA 基因型，与其他 BRA 基因型分离物氨基酸序列一致性为 96.1%—98.4%。利用 MEME 在线软件 预测 P0 蛋白的保守结构域，结果表明 P0 蛋白含有 3 个显著的保守区。分别位于第 1—60、76—125 和 161—210 氨基酸残基。通过 Datamonkey 在线服务器（）提供的 5 种运算方法分析 P0 蛋白氨基 酸位点的选择压力，结果显示 P0 蛋白具有 8 个氨基酸正向选择位点。将含有 P0 及其缺失突变体的重组质粒连同 含 EYFP 报告基因的 pTEM12 质粒采用基因枪轰击法分别导入甘蔗嫩叶组织细胞，轰击后 48—120 h，P0 和 P19 逐 渐地提高 EYFP 荧光表达点数和荧光表达水平；在 120 h，与 pUbi-nos 空载体（不含沉默抑制子）对照组相比， P0 和 P19 均显著地提高甘蔗嫩叶组织EYFP 荧光表达点数和荧光表达水平，分别达1.6 倍和4.0倍以上。P0 与 P19 抑制 RNA 沉默活性水平没有显著差异（P0.05）。P0 蛋白 N 端缺失 15 个氨基酸（P0Δ2-15 ）和 C 端缺失 102 个氨基 酸（P0Δ155-256 ）均丧失了沉默抑制子的功能，荧光表达与不含沉默抑制子对照组相当。【结论】在甘蔗嫩叶组织EYFP 瞬时表达体系上，P0 能够显著地提高外源基因 EYFP 表达水平。P0蛋白 N端15个氨基酸和C端102 个氨基酸含有 显著的保守区域，是P0发挥沉默抑制子功能所必需的。 关键词：甘蔗黄叶病毒；P0蛋白；RNA沉默抑制子；黄色荧光蛋白 Molecular Characterization and Analysis of Suppressing RNA Silence of P0 Protein Encoded by Sugarcane