柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测.pdfVIP

中国农业科学 2006,39(12):2491-2497 Scientia Agricultura Sinica 柑桔黄龙病的常规PCR及荧光定量PCR检测 1 1 1 1 1 1 2 胡 浩 ，殷幼平 ，张利平 ，赵 云 ，夏玉先 ，王中康 ，覃 健 1 2 （重庆大学生物工程学院，基因工程研究中心，重庆 400030 ； 柳州市鹧鸪江园艺场，柳州 545002 ） 摘要：【目的】为柑桔黄龙病的早期诊断和寄主体内病原菌的动态监测提供一种稳定、可靠的检验检疫技术。 【方法】利用亚洲韧皮杆菌核糖体蛋白基因 rplJ/rplL 设计 了 2 对 PCR 引物 CQULA03F/CQULA03R、 CQULA04F/CQULA04R 和 1 条 TaqMan 探针 CQULAP1，以此为基础建立了常规 PCR 和 TaqMan 探针法、SYBR Green I 荧光染料法两种荧光定量 PCR（共 3 种）反应体系；确定了 3 种体系各自的检测灵敏度、特异性和准确性，据此 对3种体系进行了比较；从2004年7月到2005年5月还利用常规PCR和TaqMan探针荧光定量PCR体系完成了对 柑桔黄龙病病原菌在寄主体内的周年变化的动态监测。【结果】两种荧光定量PCR方法的灵敏度比常规PCR高出至 少 2～3 个数量级，而 TaqMan 探针法由于使用了杂交探针，其特异性尤其可靠，另外两种定量 PCR 较小的产物片 段使得它们具有更好的稳定性，加上荧光定量 PCR 方法本身受污染可能性小、操作简便等固有优势，使得前者更 适合于柑桔黄龙病的检测。【结论】本研究建立的2种荧光定量PCR方法可以为柑桔黄龙病的病害早期诊断以及柑 桔黄龙病病原菌近缘种的甄别提供准确、灵敏、快速的检验检疫技术。 关键词：Cadidatus Liberibacter asiaticus；黄龙病；SYBR Green I；TaqMan；荧光定量PCR Detection of Citrus Huanglongbing by Conventional and Two Fluorescence Quantitative PCR Assays 1 1 1 1 1 1 2 HU Hao , YIN You-ping , ZHANG Li-ping , ZHAO Yun , XIA Yu-xian , WANG Zhong-kang , QIN Jian 1 ( Key Laboratory of Gene Function and Regulation at Chongqing, College of Bioengineering at Chongqing University, Chongqing 400030; 2Zhegujiang Arboretum at Liuzhou City, Liuzhou 545002) Abstract: 【Objective 】The project aimed to develop an accurate, sensitive and fast technique for the early diagnosis of Huanglongbing and identification of Ca. L. asiaticus. 【Method 】Conventional and two types of Fluorescence Quanti