图位克隆原理要点.pptVIP

SSLPs SSLPs 40.48% 20.00% 4.76% 4.76% 12.5% 12.5% 36% 步骤总结 筛选 F2 代 短根 移栽 提基因组 各对引物PCR 统计计算Rf 缩小范围 寻找新Marker 扩大群体 (筛选重组子) 3周左右 在突变位点附近区域内绝大部分的样品跑样结果都应该为只有非重组的Col条带，即记录Rf为0，只有少数的样品存在交换，Rf记为1。 图中的6、12号样品即为重组子 什么是重组子 在筛选出6、12号两个重组子以后，假设在目标区域内寻找到新的标记引物，就不需要把所有的个体跑样，只需要跑重组子个体 例： 筛选重组子的目的 Rf Marker1 Marker2 Marker3 6号个体 1 0 1 12号个体 1 0 0 表格的跑样结果显示Marker2最接近突变位点，Marker3次之，下一步可以在Marker2和Marker3附近寻找新标记引物 1. 建议使用一对位于相对确信的区域内的 次低重组率标记引用来筛选 2. 可以根据情况调整用来筛选 重组子的Marker 3. 要选择好用、绝大部分一次 就能扩出来的标记引物 重组子筛选 1.山大丁老师 提供的引物 2.TAIR网上提供的常用Marker 3.AMP上提供的常用Marker 4.TAIR网上公布的所有多态性位点资料 引物寻找 STEP1: 把目标区域内的Marker序列贴进TAIR网上的Seqviewer上搜索目标区域 MPK6 FP: AATCTTGTAATCTGGTGCGTG 点击目标区域 STEP2: 把目标区域内的BAC名字记录下来 例如：K14A17至MRC8之间的BAC名字有 K14A17→MCE21 →MGD8 →MTO12 →MKP6 →MIG5 →MEB5 →MBG14 →MRC8 STEP3: 把目标区域内的BAC名字分次键入到AMP的Marker搜索栏 注意: 每个株系到精确定位后期可能用到数十上百的MARKER，请将自己使用、订制过的MARKER的相关资料清晰记录下来，便于日后查看。 目标区域内基因搜索 附加 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。 隐性突变 突变基因： a（短根） 正常基因： A （长根） 显性突变 突变基因： A（短根） 正常基因： a （长根） 单基因突变 由于我们以短根为筛选突变体的指标，因此下面提到的突变的基因都应该会导致幼苗短根。 隐性突变 显性突变 单基因突变 杂交F1代 突变体 x Ler aa（短根） AA（长根） Aa（长根） 突变体 x Ler AA（短根） aa（长根） Aa（短根） 杂交F1代 隐性突变 显性突变 单基因突变 杂交F2代 Aa（长根） 3 ：1 AA Aa（长根）： aa（短根） Aa（短根） 3 ：1 AA Aa（短根）： aa（长根） 杂交F2代 隐性突变 显性突变 单基因突变 杂交F1代 突变体 x Ler aa（短根） AA（长根） Aa（长根） 突变体 x Ler AA（短根） aa（长根） Aa（短根） 注意事项：一般出现的突变大多数为隐性突变，因此理论上F1代都为长根(Aa) ; 如果不是，造成短根表型可能是2种情况： （1）突变为隐性突变，杂交不成功，种子为母本突变体自交所得（aa），表现为F1代长短分离； （2）突变为显性突变，杂交F1代为Aa（短根），杂交不成功的母本自交种为AA（短根），表现为F1代全部为短根 注意事项2：由于根长还会受环境因素影响，有时并不能准确判断，例如出现中根、或者对照也长得不好的情况。 建议处理方法：分类后全部移栽，分成长根、中根、短根等，在盆上标明，待苗长大后（2至3周后）编号后单株提取基因组，用任意一对粗定位用的SSLP引物做PCR，验证杂交苗真假。 真的F1杂交苗为双带，假的为单带（col带） 隐性突变 显性突变 单基因突变 杂交F2代 Aa（长根） 3 ：1 AA Aa（长根）： aa（短根） Aa（短根） 3 ：1 AA Aa（短根）： aa（长根