环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长和多杀菌素合成的影响.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(18):3577-3587 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.18.006 环腺苷酸受体蛋白基因的过表达对刺糖多孢菌生长 和多杀菌素合成的影响 徐 妙，邬 洋，杨 燕，夏立秋 （湖南师范大学生命科学学院/微生物分子生物学国家重点实验室培育基地，长沙 410081 ） 摘要：【目的】利用全局性调控因子环腺苷酸受体蛋白（cyclic AMP receptor protein，Crp）基因在刺糖 多孢菌（Saccharopolyspora spinosa ）中的过量表达，研究其对刺糖多孢菌生长及形态方面的影响，促进多杀菌 素的生物合成。【方法】PCR 扩增环腺苷酸受体蛋白基因（ crp ），通过限制性酶切、连接方法构建中间载体 pOJ260-cm-P -crp，使 crp 置于红霉素增强型启动子 P 的控制下；PCR 扩增 P -crp 基因片段，利用 Red/ET ermE ermE ermE 同源重组技术将 PermE-crp 亚克隆至实验室保藏的大肠杆菌-链霉菌穿梭载体 pUC-spn 上，构建成 Crp 表达载体 pUC-spn-PermE-crp。然后，采用接合转移方法将重组载体pUC-spn-PermE-crp导入野生型刺糖多孢菌中，通过单交换 同源重组将其整合至刺糖多孢菌染色体上，以染色体上整合了原始质粒 pUC-spn 的刺糖多孢菌作为对照菌株。利 用 PCR 扩增阿伯拉霉素抗性基因及目的基因的方法鉴定阳性接合子；观察工程菌株及对照菌株在不同固体培养基 中的生长及菌落形态差异，同时比较工程菌株及对照菌株在液体培养基中的生长情况，测定生长曲线。借用扫描 电子显微镜观察工程菌株及对照菌株的菌丝体形态；采用高效液相色谱检测工程菌株及对照菌株中多杀菌素生物 合成情况。【结果】采用分子生物学方法成功构建了Crp 重组表达载体pUC-spn-P -crp，并通过接合转移导入到 ermE 刺糖多孢菌中；PCR 检测结果显示，工程菌株作为模板扩增出长约 2 kb 的 cm-PermE-crp 目的条带，说明 crp 已成 功整合到刺糖多孢菌染色体上，并且获得的重组工程菌株 S. spinosa-Crp遗传性能稳定。在BHI培养基和ISP-2培 养基上，工程菌株 S. spinosa-Crp孢子萌发及形成速率与对照菌株 S. spinosa-1相比均有所延迟，但在R6培养基 上两者生长速率及菌落形态无明显差异。与对照菌株 S. spinosa-1 相比，液体培养基中工程菌株 S. spinosa-Crp 二次生长现象消失，且生物量略高于 S. spinosa-1。扫描电子显微镜结果显示工程菌株菌丝片段化程度较高，分 支较少，有利于提高工程菌株 S. spinosa-Crp发酵过程中的溶氧水平。摇瓶发酵结果表明，工程菌株中的多杀菌 素产量与对照菌株相比提高了128%。【结论】 crp 的过量表达对刺糖多孢菌的菌丝形态及生长产生一定影响，并有 效促进刺糖多孢菌中多杀菌素的生物合成，为通过其他正调控基因的超量表达促进多杀菌素的生物合成奠定了基础。 关键词：刺糖多孢菌；环腺苷酸受体蛋白；过量表达；多杀菌素；Red/ET重组 Impact on Strain Growth and Spinosad Biosynthesis by Overexpression of Cyclic AMP Recept