农杆菌介导瞬时沉默小麦HCP1的研究.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(20):4188-4196 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.20.018 农杆菌介导瞬时沉默小麦 HCP1 的研究 刘 鹏，王帅帅，杨高山，张 恒，韩胜芳，王冬梅 （河北农业大学生命科学学院，河北保定 071001 ） 摘要：【目的】建立农杆菌介导的瞬时沉默小麦HCP1 的方法，为简便、快速、高效地研究小麦基因功能提供 一种可靠的技术支持。研究 HCP1 在叶锈菌侵染过程中对H O 的清除作用，为阐明小麦抗叶锈菌侵染中信号转导机 2 2 制奠定理论基础。【方法】采用农杆菌注射法，将携带有peGFP载体的农杆菌注射到小麦叶片中，观察叶片中荧光 强度及分布，分析外源质粒在小麦叶片中的表达情况。通过注射 EHA105、LBA4404 和 C58C1 3 种不同的农杆菌菌 株，将 HCP1 的 RNAi载体导入小麦叶片细胞中，利用半定量RT-PCR和实时荧光定量PCR检测 HCP1 瞬时沉默效率， 并结合 Rohringer 染色分析，明确不同农杆菌对寄主叶片侵染能力的强弱，从而筛选出最适的试验菌株。在瞬时 沉默的小麦叶片上，接种不亲和叶锈菌小种260，利用DAB染色，观察接种叶锈菌后叶片中H O 的变化，分析 HCP1 2 2 在小麦与叶锈菌互作过程中的功能。【结果】叶片 GFP 荧光观察结果说明，在注射农杆菌 48 h 后 GFP 开始出现较 高表达。RT-PCR 和 qRT-PCR 结果表明，注射 C58C1 菌株的叶片 12 h 后，HCP1 的表达量开始降低，并持续保持较 低的表达量。注射 EHA105 菌株的叶片，在注射后 72—96 h，HCP1 的表达量迅速降低。而注射 LBA4404 菌株的叶 片中 HCP1 的表达量基本没有变化。所以在3 种不同农杆菌菌株介导的 HCP1 RNAi转化中，沉默效率依次为：C58C1 ≥EHA105＞LBA4404。注射不同农杆菌菌株叶片的Rohringer染色结果发现，EHA105侵染后引起的HR 反应较其他 两种菌株明显，说明EHA105 对小麦叶片具有较高毒性，会引起叶片产生防卫反应，C58C1菌株在具有较高的沉默 效率同时，对叶片的毒性较小，因此选取C58C1作为最适的试验菌株；沉默 HCP1 的小麦叶片接种叶锈菌小种260 后，通过DAB 染色发现，接种24 h 和48 h 后叶锈菌侵染诱发的小麦叶片H O 的分布及积累量均多于对照组。【结 2 2 论】建立了农杆菌介导的瞬时基因沉默体系，选用C58C1农杆菌菌株作为试验菌株，在处理后72 h可达到沉默目 的基因的效果。确定 HCP1 参与了小麦与叶锈菌互作过程中H O 的清除途径。 2 2 关键词：小麦；瞬时沉默；HCP1；叶锈菌；H O 2 2 Transient Silencing of HCP1 Gene in Wheat Mediated by Agrobacterium LIU Peng, WANG S