木尔坦棉花曲叶病毒及其伴随的beta;卫星分子复合侵染引起广东棉花曲叶病.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(16):3166-3175 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.16.007 木尔坦棉花曲叶病毒及其伴随的 β卫星分子 复合侵染引起广东棉花曲叶病 汤亚飞，何自福，杜振国，佘小漫，蓝国兵 （广东省农业科学院植物保护研究所/广东省植物保护新技术重点实验室，广州 510640 ） 摘要：【目的】明确引起广东棉花曲叶病的病原，为该病害的防控提供理论依据。【方法】应用 PCR、滚环扩 增（rolling circle amplification，RCA）、基因克隆及测序等技术获得病毒分离物GD01基因组及卫星分子的序 列，并对序列进行分析；通过构建 GD01 及其 β卫星分子的侵染性克隆 pGreenⅡ049-1.6A、pGreenⅡ049 -2.0 β 和利用农杆菌介导的注射接种方法，测定GD01及其 β卫星分子对棉花的致病性；进一步通过Southern blot检测 对接种植株进行分析与验证。【结果】侵染广东棉花的病毒分离物GD01基因组仅含A组分（DNA-A），其全长为2 737 nt，且与在中国发现的木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus, CLCuMuV）第一个分离物朱槿分 离物 G6 序列相似性为 100%。该病毒分离物也伴随有 β卫星分子，其全长为 1 345 nt，与 G6 伴随的 β卫星分子 （Cotton leaf curl Multan betasatellite isolate G6, CLCuMuB-[G6]）序列相似性为99.9%。构建了GD01 DNA-A 及其 β卫星分子侵染性克隆 pGreenⅡ049-1.6A、pGreenⅡ049-2.0 β，农杆菌注射接种本氏烟，接种后 15 d，二 者混合接种的本氏烟植株新出的叶片表现明显的皱缩、卷曲等症状；随着时间的推移，本氏烟的症状越来越明显。 农杆菌注射接种棉花，接种后30 d，二者混合接种的棉花植株新出叶片开始出现叶脉变深绿色，叶片卷曲等症状； 接种后90 d，二者混合接种的植株大部分叶片表现为叶片向上卷曲、叶脉深绿色、叶脉肿大等典型棉花曲叶症状， 且与田间自然病株症状相同，而二者各自单独接种的棉花植株没有产生明显的症状。Southern blot 检测结果显 示,表现典型曲叶症状的接种棉花植株均含有GD01 DNA-A 及其 β卫星分子，进一步支持这些症状是由GD01 DNA-A 及其 β卫星分子的共同侵染引起。【结论】病毒分离物 GD01 DNA-A 及其伴随的β卫星分子与入侵中国的 CLCuMuV 第一个分离物朱槿分离物G6 相同，CLCuMuV -[GD01]及其伴随的CLCuMuB -[GD01]复合侵染引起广东棉花曲叶病， 利用农杆菌介导的侵染性克隆接种法，完成了 CLCuMuV 及其 CLCuMuB 复合侵染引起棉花曲叶病的柯赫氏法则 (Kochs Postulates)。 关键词：棉花曲叶病；木尔坦棉花曲叶病毒； β卫星分子；侵染性克隆；致病性 The Complex of Cotton leaf curl Multan virus and Its Associated Betasatellite Molecule Causing Cotton Leaf Curl Disease in Guangdong Province TANG Ya-fei, HE Zi-fu, DU Zhen-guo, SHE Xiao-man, LAN Guo-bing (Plant Protection Research Institute, Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Provincial Key Laboratory of High Technolo