建立环介导间接PCR同时检测3种主要猪源性病毒.pdfVIP

中国农业科学 2011,44(21):4499-4507 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2011.21.019 建立环介导间接PCR 同时检测3 种主要猪源性病毒 郑 鸣，边传周，王老七 （郑州牧业工程高等专科学校生物技术实验室，郑州 450011 ） 摘要：【目的】建立同时检测猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪瘟病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV） 的环介导间接PCR方法，实现3 种病毒快速检测。 【方法】根据GenBank数据库中猪圆环病毒2 型（PCV2）、猪瘟 病毒（CSFV）和猪繁殖与呼吸综合征病毒（PRRSV）的核苷酸序列设计3 对特异性探针，利用PCR技术分别标记于 大豆Lectin基因片段的两端形成3 种不同的报告基因，此标记的报告基因与3 种待测靶标基因经杂交、缺口补平、 环化后，采用1 对引物反向PCR扩增报告基因，建立了PCV2、CSFV和PRRSV的环介导间接PCR检测方法，扩增片段大 小分别为564 bp、434 bp和338 bp，该方法即可用于单病毒检测又可用于多病毒检测。【结果】灵敏度和特异性 试验结果表明，无论是单病毒检测还是多病毒检测，该法都具有高度特异性，与其它病原检测无明显交叉反应； 对PCV2、CSFV和PRRSV 3 种病毒同时检测的底限分别为0.8、25 和6.2 pg·μL-1，和单个病毒的检测灵敏度相同。 利用环介导间接PCR和常规PCR对 20 份临床样本进行比较检测，结果表明，无论单病毒检测还是多病毒检测,其结 果均与常规PCR检测结果完全一致。【结论】环介导间接PCR检测技术可用于PCV2、CSFV和PRRSV 3 种病毒的同时 检测，是一种简便快速、灵敏、特异的病原学诊断工具。 关键词：猪圆环病毒2 型；猪瘟病毒；猪繁殖与呼吸综合征病毒；环介导间接PCR Development of Loop-Mediated Indirect PCR for Simultaneously Detecting Three Species of Viruses in Pigs ZHENG Ming, BIAN Chuan-zhou, WANG Lao-qi (Laboratory of Biotechnology, Zhengzhou College of Animal Husbandry Engineering, Zhengzhou 450011) Abstract: 【Objective 】 The aim of this study is to establish a method of loop-mediated indirect PCR assay for simultaneous identification of porcine circovirus type 2 (PCV2), classical swine fever virus (CSFV) and porcine reproductive and respiratory syndrome virus (PRRSV) in pigs. 【Method 】 According to the nucleotide sequences of PCV2, CSFV and PRRSV from GenBank, three pairs of specific probes were designed. By PCR, the Lectin gene fragment of soybean was labeled with different probes to be used as reporter genes aiming to the nucleotide sequences of PCV2, CSFV and PRRSV, respectively.