家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂BmCPI40鉴定及时空表达特征.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(13):2645-2655 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.13.016 家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂 BmCPI40 鉴定及时空表达特征 李建伟，李 懿，周小英，黎治浪，陈世达，田 莎，侯 勇，夏庆友 （西南大学生物技术学院/家蚕基因组生物学国家重点实验室，重庆 400716 ） Bombyx mori ）半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并对其表达特征及调控进行分析，为深入 摘要：【目的】鉴定家蚕（ 研究半胱氨酸蛋白酶抑制剂在家蚕变态发育中的作用提供数据支持。【方法】根据家蚕基因组数据库和Primer 5.0 软件设计 BmCPI40 去信号肽引物，对家蚕半胱氨酸蛋白酶抑制剂 BmCPI40 进行克隆，利用 Clustal X 和 MEGA4.0 软件对 BmCPI40 进行氨基酸序列和进化关系分析。采用原核表达系统对重组的 BmCPI40 进行表达、纯化和抗体的 制备。运用 RT-PCR 和 qPCR 技术在核酸水平分析 BmCPI40 时空表达特征，利用 Western 和免疫荧光技术分别对 BmCPI40 进行蛋白水平检测和组织定位。qPCR 方法检测 20E 诱导条件下 BmCPI40 在家蚕体壁中的表达量变化。用 20E处理细胞，双荧光素酶报告系统对 BmCPI40 启动子序列活性进行检测，探究BmCPI40调控方式。【结果】鉴定、 克隆、表达了家蚕的半胱氨酸蛋白酶抑制剂，并命名为 BmCPI40，其ORF全长366 bp,编码121个氨基酸，其中前 18 氨基酸构成其信号肽，编码蛋白质大小约为 12 249.21 Da，等电点为 4.43；进化树分析显示 BmCPI40 与一些 病原微生物半胱氨酸蛋白酶的抑制剂结构域进化关系较近；BmCPI40 的原核表达结果表明，重组的 BmCPI40 以可 溶蛋白的形式表达；BmCPI40 5龄第3天各组织Western blot结果显示，其主要存在于家蚕表皮中，头部也有微 量存在；时期检测结果表明，BmCPI40 幼虫期表达量明显高于蛹期，眠期及变态期表达量下调明显，这与核酸水 平的qPCR结果相一致，进一步的体壁免疫荧光定位证实BmCPI40主要存在于体壁的皮细胞周围；qPCR表明，20E 诱导5龄第 2 天家蚕幼虫后，BmCPI40 表达量减少；双荧光素酶检测结果显示，20E诱导细胞后，BmCPI40 启动子 序列荧光素酶活性下降，证实 BmCPI40 受到了蜕皮激素的抑制作用。【结论】 BmCPI40 的表达受到蜕皮激素的诱 导下调，同时其可能参与了家蚕的蜕皮及变态发育过程。 关键词：家蚕；半胱氨酸蛋白酶抑制剂；蜕皮；变态发育 Identification and Analysis of the Characteristics of Spatial and Temporal Expression of Bombyx mori Cysteine Protease Inhibitor BmCPI40 LI Jian-wei, LI Yi, ZHOU Xiao-ying, LI Zhi-lang, CHEN Shi-da, TIAN Sha, HOU Yong, XIA Qing-you (College of Biotechnology, Southwest University/State Key Laboratory of Silkworm Genome Biology, Chongqing 400716) Abstract: 【Objective 】 The objective of this study is to identify a newly discovered cysteine protease inhibitor of silkworm (Bombyx mori) and to investigate the expression characte