利用E.coli表达猪圆环病毒2型Cap蛋白生产病毒样颗粒疫苗.pdfVIP

中国农业科学 2015,48(5):976-986 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2015.05.16 利用 E.coli 表达猪圆环病毒2型Cap蛋白 生产病毒样颗粒疫苗 1, 2 1 1 1 1 2 1 1 赵晓云 ，乔绪稳 ，陈 瑾 ，李鹏成 ，于晓明 ，朱国强 ，郑其升 ，侯继波 1 2 （国家兽用生物制品工程技术研究中心，南京 210014 ； 扬州大学兽医学院，江苏扬州 225009 ） 摘要：【目的】研究利用大肠杆菌可溶性表达 PCV2b 亚型 ORF2 基因，利用重组 Cap 蛋白制备 PCV2 VLP 疫苗 的可行性。【方法】 根据大肠杆菌密码子使用频率表优化合成 PCV2 NJ 株 ORF2 基因，将其插入原核表达载体 pQZ1，鉴定阳性后转入表达宿主菌 BL21，利用原核表达平台 CVC1102 对重组菌进行诱导表达。利用 SDS 与Western blotting对目的基因的表达及产物的可溶性进行分析；利用电镜分析技术鉴定重组Cap蛋白VLP组装； 利用 BCA 试剂盒测定重组大肠杆菌破碎后上清中总蛋白量，利用薄层扫描分析确定目的蛋白百分比，得出目的蛋 白量，将重组Cap蛋白的浓度调整为1 mg·mL-1 。使用不同剂量的重组蛋白与206佐剂乳化，免疫2—3 周龄抗原抗 体双阴性的仔猪，同时设含免疫增强剂CVC1301、CVC1302 的试验组、同类制品免疫对照组与空白对照组，免疫后 14 d 与 21 d 所有试验猪采血，分离血清，利用武汉科前生物科技有限公司的猪圆环病毒 2 型抗体 ELISA 检测试 剂盒检测试验猪血清中PCV2 抗体水平；免疫后28 d试验猪按照兽用生物制品质量标准汇编中公布的PCV2攻毒程 序，利用PCV2 NJ株F 5.0 代进行强毒攻击试验，肌肉注射与口服PCV2 NJ株各10 TCID ，同时利用乳化的钥匙孔血 6 50 蓝蛋白及硫酸巯基乙醇培养基进行免疫刺激，攻毒后25 d，对所有试验猪进行解剖检测，通过攻毒过程中试验猪 体温变化、试验猪平均相对日增重、解剖时试验猪肺部与相关淋巴结的大体变化及攻毒后PCV2核酸检测等4个方 面评价大肠杆菌表达制备的PCV2 VLP的免疫效力。【结果】SDS结果表明PCV2 NJ株优化的ORF2基因在大 肠杆菌中得到了高效表达，表达产物以完全可溶性形式存在于菌体超声波破碎后的上清中；Western blotting分 析结果显示表达的重组 Cap 蛋白能够与 PCV2 阳性血清发生反应；电镜下观察可见大量直径在 17 nm 左右的 PCV2 病毒样颗粒存在于超声破碎后的上清中；500 μg/头重组 VLP 疫苗免疫猪产生较高的抗体水平，单次免疫后 21 d 抗体 100%达到合格，对 PCV2 强毒的攻击提供完全保护。【结论】实现了 PCV2 Cap 蛋白在大肠杆菌中高效可溶性 表达，重组Cap蛋白体外自我组装成病毒样颗粒，且具有良好的免疫原性，可用于制备PCV2亚单位疫苗。 关键词：猪圆环病毒2型；ORF2基因；可溶性表达；病毒样颗粒；免疫原性 PCV2 Virus Like Particles Vaccine Produced with Recomb