利用RNAi抑制B-hordein合成降低大麦籽粒蛋白质含量.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(19):3746-3756 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.19.003 利用RNAi抑制 B-hordein 合成降低大麦籽粒蛋白质含量 1 2 3 1 李静雯 ，张正英 ，令利军 ，李淑洁 1 2 3 （甘肃省农业科学院生物技术研究所，兰州 730070 ； 甘肃省农业科学院科研管理处，兰州 730070 ； 西北师范大学生命科学学院，兰州 730070 ） 摘要：【目的】通过RNAi策略抑制大麦籽粒B-hordein 的表达，获得高氮肥水平下籽粒蛋白质含量降低的转 基因大麦新种质，探索大麦品质改良新途径。【方法】采用同源PCR技术克隆大麦B-hordein 核心保守序列，通过 Gateway 技术构建大麦 B-hordein 的 RNAi 植物表达载体 pBract207-zz-gp4，利用农杆菌介导法转化大麦 Golden Promise幼胚，获得转基因植株。通过PCR 检测、Southern杂交验证RNAi构件在转基因大麦及其后代基因组的整 合情况。采用半定量RT-PCR分析转基因大麦花后不同发育时期 B-hordein 转录表达情况。基于近红外谷物分析仪 测定蛋白质含量，并进行醇溶蛋白SDS检测，以筛选蛋白质含量降低的转基因大麦株系。开展氮肥运筹相关 试验，检验 RNAi 效率及高氮肥水平下转基因大麦蛋白质含量变化情况。【结果】获得大麦B-hordein 片段 2 条 （Gp4和Gp5），测序结果表明该片段大小为349 bp，聚类分析表明该序列跟已知大麦醇溶蛋白基因同源性最高达 92%，与该基因已登录的 mRNA 序列同源性高于 98%，确认所得片段为大麦 B 醇溶蛋白基因片段。利用 Gateway 技术将 Gp4 片段正反向插入载体 pBract207，反向重复序列用 i18 和 iv2 intron 连接，构建了 Ubi 启动子驱 动的大麦 B-hordein RNAi 植物表达载体 pBract207-zz-gp4。通过农杆菌介导转化大麦 Golden Promise 幼胚， 结合目标基因及筛选标记基因的 PCR 验证，获得含有 RNAi 构件及筛选标记基因的转基因大麦株系 11 个。 Southern 杂交检测表明 RNAi 构件已经稳定整合到 T /T 转基因大麦基因组。随机选取 6 个 T 转基因大麦株系， 2 3 3 半定量 RT-PCR 结果表明花后不同发育时期转基因大麦籽粒 B-hordein 表达水平明显低于非转基因对照，20 d 时转基因株系表达量不仅相比同期对照降低 28.19%—55.19%，而且在各时期中也最低。利用随机选取的 T1 和 T3 籽粒进行蛋白质含量测定表明 8 个转基因大麦株系的蛋白质含量相比非转基因对照显著降低，SDS电 泳结果显示与非转基因相比，转基因各株系 B-醇溶蛋白比率有不同程度降低，其中 3 个株系 B-醇溶蛋白比率 降低明显，平均减幅为 49.42%。采用蛋白质含量降低的转基因大麦株系 RNAi-20 开展氮肥运筹试验，结果表 明，高氮肥水平 HN 及 HN 处理，该株系蛋白质含量显著低于非转基因对照；施以等量高氮肥时，伴随氮肥后 2 3 移（HN 到 HN ），该株系总蛋白含量相对非转基因对照逐渐降低。SDS电泳结果显示 B 醇溶蛋白含量降低， 2 3 电泳带型发生变化。【结论】RNAi 技术能抑制籽粒B-hordein 表达，降低 B-醇溶蛋白含量，高氮肥水平下能