小麦蛋白激酶TaMAPK2互作蛋白的筛选与验证.pdfVIP

中国农业科学 2014,47(13):2494-2503 Scientia Agricultura Sinica doi: 10.3864/j.issn.0578-1752.2014.13.002 小麦蛋白激酶TaMAPK2 互作蛋白的筛选与验证 1,2 2 2 2 2 1 2 于太飞 ，徐兆师 ，李盼松 ，陈 明 ，李连城 ，张俊华 ，马有志 1 2 （东北农业大学农学院，哈尔滨150030； 中国农业科学院作物科学研究所/ 国家农作物基因资源与基因改良重大科学工程/ 农业部麦类生物学与遗传育种重点实验室，北京 100081） 摘要：【目的】利用构建的干旱胁迫处理的小麦cDNA 文库，通过酵母双杂系统筛选与小麦TaMAPK2 互作的蛋 白，并对其进行验证分析。【方法】以小麦cDNA 为模板克隆得到TaMAPK2，构建pGBKT7-TaMAPK2 诱饵载体，将诱 饵载体 pGBKT7-TaMAPK2 质粒以及 pGADT7 和小麦 cDNA 文库共转化酵母 AH109 菌株感受态细胞，在 SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade 营养缺陷型培养基上 30℃培养3—5 d，挑选单克隆于YPDA 培养基中培养，吸取 1 μL 各候选克隆的菌液点至于SD/Raf/Gal/x-gal 平板上培养，筛选蓝色单克隆。将筛出的单克隆经测序、序列比对分 析，初步获得与 TaMAPK2 互作的候选蛋白。采用双酶切的方法构建 pGADT7-HSP90 以及 pSPYNE-TaMAPK2 和 pSPYCE-HSP90 双分子荧光互补表达载体，将重组载体质粒pGADT7-HSP90 和pGBKT7-TaMAPK2 共转化AH109 酵母感 2+ 受态细胞，利用酵母双杂交的方法验证 TaMAPK2 与候选蛋白HSP90 的相互作用；采用PEG-Ca 介导法将双分子荧 光互补表达载体pSPYNE-TaMAPK2 和pSPYCE-HSP90 共转化小麦原生质体细胞，激光共聚焦显微镜下观察相互作用 产生的 YFP 荧光信号。根据HSP90 的保守序列设计特异引物，在SYBR Green Ⅰ的检测模式基础上，构建 HSP90 的实时荧光定量PCR 检测体系，检测HSP90 在不同胁迫处理以及不同组织的小麦植株中的表达量。【结果】通过对 候选蛋白的初步分析表明这些候选蛋白主要参与植物体的信号转导或免疫过程，表明 TaMAPK2 在植物的逆境信号 转导、基因转录调控过程中发挥着重要作用。通过酵母双杂交显蓝系统和双分子荧光互补技术（BiFc ）进一步确 认HSP90 与TaMAPK2 的互作关系。HSP90 定位在细胞核、细胞膜以及细胞质中，且在植物的根茎叶中均有表达， 在根中的表达量最高。通过实时荧光定量PCR 分析显示，HSP90 基因受到高温、低温、高盐和ABA 胁迫后表达量 上调。【结论】HSP90 作为分子伴侣，在降解这些受损或异常蛋白以及调控抗逆相关转录因子表达的过程中发挥着 重要的作用。非生物胁迫会引起植物体内一些受损或异常蛋白聚合物的积累，HSP90 能通过折叠已损坏的蛋白底 物以及构象的维持来保持细胞的完整性。表明在植物逆境信号转导过程中，TaMAPK2 功能的发挥可能需要 HSP90 蛋白的参与。 关键词：小麦；酵母双杂交系统；MAPK；蛋白互作；信号转导 Screening and Identification of Proteins Interacting with TaMAPK2 in Wheat 1,2