zwittericin a生物合成基因簇的研究.pdfVIP

摘要 苏云金芽孢杆菌(Bacillus 兰氏阳性细菌，在特定生理阶段产生芽孢，并形成具有杀虫活性的伴孢晶体。 随着对Bt研究的不断深入，又发现了许多与杀虫相关的其它有效成分，如辅 Proteins，VIPs) A。Zwittermicin 和增效物质Zwittermicin A是一种新型广谱抗生素，该抗生素 可抑制多种真核微生物和原核微生物，其中包括多种植物病原菌，而且与Bt毒 素共同使用能显著提高其杀虫活性。本文对国内～批Bt菌株进行了筛选；对影 A合成基因簇进行了克隆、分析、及部分开放阅读框的功能验证。 采用PCR与抑菌活性相结合的方法对国内196株Bt菌株进行筛选，有67 株菌有抑菌活性，其中2l株抑菌活性明显高于其余的46株。 Bt菌株G03高产Zwittermicin A，有很高的抑蓠活性。选用营养程度不同 的培养基对Bt菌株G03进行培养、结合菌体观察和培养液上清液活性测定，证 上清液的抑荫活性差异，证明ZwittermicinA的生成和分泌之间有时间的延迟； 境中活性较高。 从G03克隆了zmaR全长基因，并完成了序列测定。该基因编码区为1125bp， 菌BL21获得对ZwittermieinA的抗性。 个克隆进行筛选，得到4个阳性克隆，其中两个阳性克隆(插入片段分别为65kb 分ZwittermicinA合成基因簇)。 对插入片段为65kb的阳性克隆进行测序、分析，得到36．665kb的序列，共 A合成基因簇基础上又发现了 包括15个开放阅读框，在已发表的Zwittermicin 完整的orf9，和5个新的开放阅读框，3个位于已发表序列的上游，命名为orfA、 阅读框编码的蛋白与聚酮类抗生素和多肽类抗生素合成酶有较高的同源性， ZwittermicinA的合成可能是聚酮类抗生素和多肽类抗生素的杂合途径。 对orfC的功能基因进行了验证，通过重叠PCR方法构建了orfC的突变盒， Zwittermicin A的Bt菌株218，经高温突变获得orfC突变株，突变株丧失了抑 菌活性。将orfC全长基因导入突变株后，又使其恢复了抑菌活性，表明。啦是 ZwittermicinA合成必需的。 本研究为进一步开展ZwittermicinA同Bt增效作用及其分子机制的研究提 供了有力的保障，并为进一步解析ZwittermicinA的合成途径提供了依据。 A生 A；BAC文库：Zwittermicin 关键词：Bacillusthuringiensis；Zwittermicin 物合成基因簇 ResearchonZwittermicinA cluster biosynthesis Ph．D Candidate：ShaoTie．mei Major：PlantPathology Supervisor：HuangDa—fang(prof．) Liu Da-qun(Pmf．) Abstraet Bacillus isall thuringiensis ubiquitous bacterium， is whichwell-knownand