免疫金标记技术速检测转bt基因棉抗性的研究.pdfVIP

摘要 转Bt基因棉抗虫性的检测是转Bt基因棉的研究、选育和种子生产的重要环节， 对保证种质纯度有重要意义，建立检测灵敏度高、操作简便的快速检测方法是当前急 待解决的问题。本次研究的主要目的是建立快速检测Bt毒蛋白的胶体金免疫检测技 术。其结果如下： 1．Bt毒蛋白的分离与纯化及其多克隆抗体的制备 本研究从苏云金芽孢杆菌库斯塔克亚种HD一73中分离提取Bt前毒素蛋白，利用 碱裂解法，酸沉淀粗提前毒素蛋白，再经胰蛋白酶水解，凝胶层析柱纯化得到电泳纯 Bt毒蛋自，并以此为抗原免疫兔子，从兔抗Bt毒蛋白血清中分离纯化多克隆抗体， 为进～步的Bt毒蛋白的免疫检测奠定基础。 2．胶体金及金标抗体的制备 胶体金制各方法较多，可以根据不同粒径需要选择适当的方法。本次试验采用柠 檬酸三钠还原法制备20—30hm的胶体金，用可见光光谱法对本次试验制备的胶体金 进行鉴定，结果显示紫外分光光度计450—800nm扫描曲线光滑，峰宽较窄，证明胶体 p 会质量合格。稳定iml胶体金的最低蛋白质的量为20g兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体。 制备的余标抗体经质量和稳定性鉴定均合格。 3．检测Bt毒蛋白免疫层析试验模型的建立 本研究建立了检测Bt毒蛋白免疫层析试验的模型，其检测Bt毒蛋白免疫层析 其中检测线为兔抗Bt毒蛋白多克隆抗体，质控线为羊抗兔抗体。然后组装试纸条： 将吸水拱，硝酸纤维索膜，玻璃纤维素条依次粘好，相连部分相互重叠2mm，整个试 纸条的前后各粘一层黄色胶带，将前、后端上下包封住，用切割器切成4mm宽的条带。 用体积为150pl。 试纸条具体操作步骤如下： (1)取出试纸条恢复至室温。 (2)将有胶体金复合物端插入检测样品。 (3)10一20min判断结果。 (4)结果判断 a．试纸条仅质控点(加羊抗兔抗体)出现一紫红色点者判为正常(阴性结果)。 b．试纸条上出现两个紫红色点者为阳性结果。 C．试纸条两端都没有紫红色点出现者则为无效结果。说明此试纸条已经失效。 试纸条灵敏度测试试验结果表明，试纸条检测极限为lOng／ml。试纸条4℃干燥 保存一个月后再进行试验，结果稳定。 4．检测8t毒蛋白免疫斑点金染色法模型的建立 本文建立了用免疫斑点金染色法检测Bt毒蛋白的检测模型，其具体方法为在 um硝酸纤维素膜(NC)，画出O．8cm见方的格子，在格子中央 MilIpore孔径为0．45 u 点待测样品l l，自然晾干。用0．OIM pH7．2的PBS洗涤后，将硝酸纤维素膜(NC 膜)置于封闭液中，室温孵育30min后，分别用蒸馏水和0．OIM pH7．2的PBS洗涤数 次。再将硝酸纤维素膜浸泡于稀释4倍的金标抗体溶液中，置于室温孵育30min，观 察结果：出现紫红色为斑点阳性结果，无紫红色斑点则为阴性结果。其检测极限为 16ng／ml。 关键词：免疫金标记技术：免疫层析法：免疫斑点金染色法：转Bt基因棉：抗性鉴 定 Abstract theidentificationofresistancetocoRon boll Testing wormof cotton Bt—transgenic is tothe of research the Bt-transgeniccotton，select important good Bt-transgenic