土壤消毒及土传原真菌的分子生物学鉴定.pdfVIP

摘 要 本研究旨在筛选溴甲烷土壤消毒的有效替代品，并探讨快速有效的分子生物学方法定性 定量研究土传病原真菌，综合评价土壤消毒的药效，为十．壤消毒防治土传病害提供更为科学 的依据。通过常规的病原菌分离培养方法分离重要的土传病原真菌，采用改进的冷冻研磨 进行克隆测序．设计特异性引物，并进行引物特异性及灵敏性检验。根据所设计的特异性引 物，采用实时荧光定量PcR方法对硫酰氟处理后士样中病原真菌进行定性定量研究，并结合 病原菌传统培养计数的方法，综合评价硫酰氟土壤消毒对士传病原真菌的控制效果。通过本 研究，得到如下结果： (1)采用不同剂量的硫酰氟室内土壤熏蒸。结果表明硫酰氟用量在5．44×l盯2窖，【，43．52 ×l护E，L对土壤中尖镰刀菌有很好的防效．与本室所做的硫酰氟田间药效试验结果相一致， 说明硫酰氟是很有潜力的土壤熏蒸剂。 (2)从采集的保护地病士与典型病组织中成功分离到辣椒疫霉，番茄晚疫病菌，尖镰刀 菌，瓜果腐霉，链格孢。并收集培养了寄生疫霉，苎麻疫霉，棉尖镶孢，燕麦镰孢，串珠镰 孢，禾谷镰孢，腐皮镰孢，大丽轮枝菌，番茄灰霉等菌株。 (3)对冷冻研磨crAB法进行改进后，成功提取多种真菌的基因组DNA。并对腐皮镰 孢，分离的镰刀菌，辣椒疫霉，番茄晚疫病菌，大丽轮枝菌，瓜果腐霉的rrs区进行克隆测 果显示腐皮镰刀菌和分离的镰刀菌均与尖镰刀菌的一个专化型凡Mr缸m“，spo九|mf观 me如nj同源性高达99％以上，推测它们的分类地位可能都应归属于n‘?口腑m n聊DMnf跗 me，Dnf．其余菌株序列比对，结果显示其种属名均与G∞Bank中报道的一致。 (4)对分离的镰刀菌．辣椒痰霉．大丽轮枝菌三种重要土传病原真菌设计了特异性引物。 均为65℃时。三对引物均具有良好的特异性和灵敏性。 (5)以不同赉j量硫酰氟处理后的土样为样本，根据所设计的特异性引物，采用荧光定量 PcR方法对土样中病原真菌进行定性定量研究。结果表明，可准确定量不同处理土样中尖镰 刀菌的rDNA拷贝数，显示硫酰氟对该菌有很好的控制效果，并明确了尖镰刀菌是满城草莓 病害一个重要致病菌，初步形成了土传病原真菌快速有效的分子检测技术。 实时荧光定量PcR技术可以对DNA模扳准确定量，灵敏度高、特异性和可靠性强，将 其应用到农药药效研究领域，通过对土传病原真菌进行定性定量研究，从新的角度来评价土 壤消毒的药效，为农药药效研究提供了新的研究途径。 关键词 土壤消毒；土传病原真菌；克隆测序；特异性引物；荧光定量PcR Abstract ’I’he oftheresearchlstoscreenoutsomee丘ec“Ve aItemativesarId puIpose methylbmInlde aIldreliablemolecularmemodto and identify devel叩ar叩id quantifysoilbome凡n百．some soilbomewereisolated mechod．AndtheITS oftheisolated imponaIlI fungi by吨dilional regions c10nedaIld therDNAITswere fuIl西were sequenced，sp。cies-spec讯c埘m∞b船eddesigIled． ThenweIlsedreal砸mePcRto tllesoil were whicht|cated诵ttl quanti母soilbome缸垂ins帅ples