通过共转化法培无抗性选择标记的转反义wx基因水稻的研究.pdf

通过共转化法培育无抗性选择标记的 转反义黻基因水稻的研究 摘要 本试验以具不同直链淀粉含量的粳稻品种粳9983和广陵香粳，籼型杂交稻重 点亲本协青早、龙特甫和珍汕97为受体材料，经根癌农杆菌介导的双载体或超双 元载体共转化技术将分别含有潮霉素抗性(HPT)选择标记和反义耽基因的两个 T-DNA区导入上述受体来源的愈伤组织中，通过检测To代转基因水稻植株中}{PT 基因与反义阡j基因的共整合情况及在T·代植株间的分离情况，来研究不同的共 转化技术路线中共转化的效率及对去除抗性选择标记的效果，进一步为用基因工 程技术改良稻米品质提供依据和育种材料。同时，本研究还试验了农杆菌介导的 双载体共转化法中影响共转化效果的部分因素。所得结果如下： 1．为研究农杆菌介导的双载体共转化中所采用的菌株及配比浓度对共转化效 率的影响，将分别含有HPT选择标记和GUS目的基因的两个双元载体 获得的抗性愈伤组织或再生转基因植株的共转化率为依据，研究了在同一浓度比 下不同农杆菌菌株搭配．以及在固定两种菌株搭配时不同浓度比对双载体共转化 效率的影响。结果表明，当两种农杆菌浓度比固定为1：1时，不同菌株组合的共 的共转化效率最高：在以这种组合进行共转化时，两种菌株不同的浓度比对共转 化率也有明显的影响，其中以浓度比为1：2时共转化效率最高。 2．将T—DNA区分别含有HPT选择标记与反义版基因的两个双元载体分别 导入农杆菌EHAl05中，以1：2浓度比混合两种菌株用于共侵染水稻幼胚来源的 愈伤组织，在粳9983、协青早、龙特甫和珍汕97四个品种中分别获得了92、23、 25和8个独立的抗性转化系。PCR分析表明，四个品种中分别有9、3、2和1个 共转化系，总的共转化率为10．1％。对部分共转化植株自交Tl代株系的PCR分析 表明，反义版基因和抗性选择标记基因可以在共转化植株后代间发生分离，从而 选择到只含有反义脓基因而没有HPT选择标记的转基因植株。 3．含有两个T．D咐A区结构(两个T—DNA区分别含有HPT选择标记基因与 反义阡x基因)的超双元载体pYH592，经农杆菌介导侵染粳9983和龙特甫幼胚 来源的愈伤组织，分别获得98和7个独立的抗性转化系。PcR分析证明其中的43 和3个抗性转化系中含有反义胁基因，总的共转化率为43．8％，明显高于双载体 共转化法的共转化频率。对部分共转化植株自交TI代株系的PCR分析表明，反义 耽基因和肿T选择标记同样可以在共转化植株后代间发生分离。 4．经上述两种共转化方法导入反义脓基因后，共转化水稻植株T，代种子中 的直链淀粉含量已有不同程度的下降。在个别来源于龙特甫的共转化植株中，单 粒成熟种子的直链淀粉含量最低已降至2．4％，比未转化对照下降了90．9％。 5．为研究不经抗性选择、直接获得转目的基因水稻的效果，本研究以不含 愈伤组织，共培养后不经抗性筛选，直接分化成苗，共获得了93个独立的再生系。 经PCR分析，在其中的3个独立再生系中检测到目的基因的整合，转化率为3．2％。 由此表明，通过一步法可直接获得无抗性选择标记的转目的基因水稻，但转化率 明显偏低。 关键词：无抗性选择标记，转基因水稻，反义耽基因，共转化，农杆菌，直链淀 粉含量 for ofselectable ofrice Co．”ansfo衄ation production HjX marker-fI．ee antisense containing gene transgenicplants Abstract IIlorder selecta：ble rice t0口roduce marker．矗_ee(SMF)仃aⅡsgenjccomailliIlg