07 实验七 等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点.pptVIP

实验七 聚丙烯酰胺凝胶等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点 一、目的要求 1.学习和掌握圆盘电泳技术 2.学习和掌握等电聚焦电泳测定蛋白质的等电点原理和方法 二、原理 蛋白质属于两性电解质，所带电荷的性质与数量与所处环境的pH值有关： 环境pHpI，带正电，电场下向阴极移动； 环境pHpI，带负电，电场下向阳极移动； 环境pH=pI，不带电，电场下不移动。 有一类两性电解质：它具有依次递变而又相差不大的等电点，在电场下形成递变而又连续的pH梯度，故在电泳介质中加入这种物质则能造成介质pH由酸到碱逐步变化。 两性电解质载体(carrier ampholytes) (1)易溶于水，在pI处应有足够的缓冲能力，形成稳定的pH梯度，不致被蛋白质或其它两性电解质改变pH梯度。 (2)在pI处应有良好的电导及相同的电导系数，以保持均匀的电场。 (3)分子量小，可通过透析或分子筛法除去，便于与生物大分子分开。 (4)化学性能稳定，与被分离物不起化学反应，也无变性作用，其化学组成不同于蛋白质。 图 聚丙烯酰胺凝胶圆盘电泳示意图(A为正面,B为剖面) 四、操作方法 1. 凝胶柱的制备 （1）玻璃管的一端插在橡皮帽中 （2）配胶 表 10mL 7.5%凝胶的配制 试 剂 名 称 体积(mL) 凝胶贮液