mig-6在非细胞肺癌增殖、侵袭及凋亡中的作用研究.pdf

—1￡·—．L一—1￡．——1一65 ·中文论著摘要· Mig．6在非小细胞肺癌中表达下调并与EGFR 信号通路相关 刖 舌 肺癌是当今世界上对人类健康和生命威胁最大的恶性肿瘤之一，也是临床治 疗疗效最差的恶性肿瘤之一。2012年美国癌症死因统计显示肺癌的死亡率在过去 的30年内上升了200％，死亡率居恶性肿瘤之首。我国肺癌发病率近年来持续上 升，2011年卫生部统计结果显示，肺癌位居我国癌症死因的第一位。肺癌的防治 是全世界共同面对的一项难题。大约有85％的肺癌为非小细胞肺癌(NSCLC)， 主要分为两种组织学类型：腺癌和鳞癌。 关于肺癌的病理学研究很多，目的是发现新的治疗靶点。近年来有EGFR酪 果。 表达在许多生理和病理状态下被一些因子如激素、生长因子等强烈诱导。它是 EGFR通路的负向调控因子，能够通过负反馈抑制EGFR信号的激活并影响它的 稳定性。它在人体分布广泛，与多种肿瘤的发生有密切关系。 但是，Mig一6在非小细胞肺癌中的表达及其与临床病理因素的关系并未见文 献报道，Mig-6的变化影响肺癌细胞生物学功能及其作用机制也未有研究。为了 临床病理因素的关系，通过干扰肺癌细胞系H1299和BEl中Mig．6基因的表达， 探讨了Mig．6对肺癌细胞侵袭、增殖能力的影响及其相关机制。 材料和方法 1、患者及标本 这项研究在中国医科大学伦理委员会的批准下进行。来自2008．20101年在 中国医科大学附属第一医院手术的病人，组织经10％中性福尔马林固定，石蜡包 埋。这些患者在手术前均未接受放化疗。组织学诊断和分化程度根据WHO分类 标准进行判定，按国际抗癌联盟的肺癌P．TNM分期标准． 2、免疫组织化学染色 将石蜡包埋的肺癌组织块切成4lxm厚切片，癌旁的正常支气管上皮作为阴性 位病理医生对切片分别作出判定，每张片子随机选五个高倍镜视野。 3、细胞培养 使用RPMI 1640培养基含10％的灭活小牛血清．37。C、5％C02的条件下培养，每 两天换一次液，并用0．25％的胰酶进行传代。 4、EGFR突变分析 75例石蜡包埋的肺癌标本用于EGFR突变检测，原发肺癌组织均来自 2009．2011年在中国医科大学附属第一医院手术的病人． 5、小干扰RNA实验 照均购自上海吉玛公司，采用DharmaFECT 1转染试剂进行转染，转然后48h使 用PCR和Westernblot检测干扰效率。 6、real—time Green method) PCR(SYBR Minikit提取总RNA．使用 对于新鲜培养的细胞或新鲜肺癌组织采用RNeasyplus SYBRGreenPCRmaster mix进行定量real．time PCR扩增，总体积20“l。使用 7900HT实时定量PCR仪。 7、Westem blot法检测蛋白表达 收集细胞并加入裂解液充分裂解，提取上清为总蛋白。凝胶电泳、转印、室 温封闭抗体40C孵育过夜。二抗室温孵育2h显色，结果经自动电泳凝胶成像分 析仪采集进行灰度测定。 8、细胞增殖能力实验 2 使用Cell Counting 能力． 9、细胞侵袭能力检测 使用24孔Transwell小室，孔径8 lam(Costar)进行细胞侵袭能力检测随机选取 10个高倍镜视野取平均值。每个实验组重复三次实验。 10、数据分析 采用SPSS16．0统计软件分析。 结果 1、Mig．6蛋白表达的临床