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Rb基因在调控耳蜗支持细胞增殖中的作用及机制 摘要 耳蜗毛细胞可将声波的震动转化为生物电信号，是听觉系统的关键组成部 分。但毛细胞极易因噪音、药物和年龄等因素受损，而哺乳动物的耳蜗毛细胞没有 天然的再生能力，一旦受到损伤，即可造成永久性的听力丧失。但是在低等的脊椎 动物中，毛细胞的损伤可诱导周围的支持细胞分裂增殖和向毛细胞转分化，最终替 代受损毛细胞，维持和恢复感觉上皮的功能，提示支持细胞可能是再生毛细胞的潜 在干细胞。最近研究结果显示体外分离培养的小鼠耳蜗支持细胞也能够增殖并向毛 细胞转分化，并且该过程中出现了细胞周期抑制因子的下调，表明在哺乳动物耳蜗 内，支持细胞也可能具有毛细胞再生潜力，且细胞周期抑制因子的下调很可能对其 重新进入细胞周期的启动起到重要推动作用。视网膜母细胞瘤蛋白(Rb)是细胞周期 调控中起关键作用的抑制因子，可以抑制完成细胞周期所需基因的表达。在感觉前 体细胞中定向敲除Rb基因，可使前体细胞长时间处于增殖状态，并分化出大量毛 细胞和支持细胞。但R6基因在小鼠耳蜗毛细胞内定向敲除后，虽然毛细胞也能进 入细胞周期，但并不能完成分裂并引起细胞的增殖，反而启动了细胞凋亡。目前， Rb在耳蜗支持细胞的表达和作用并不明确。本课题通过在出生后的小鼠耳蜗支持 细胞内定向敲除鼢基因，对哺乳动物耳蜗支持细胞在毛细胞再生中的潜能进行研 究，以期为耳蜗毛细胞再生的机制研究和临床治疗提供更有效的方案。 课题主要研究方法和内容如下： 一、分析Proxl—CreERr2小鼠系在耳蜗内的Cre重组酶活性。 4 染色并结合毛细胞特异性标记抗体My07a的双重染色，以显示具有Cre重组酶活 性的细胞及其相对于耳蜗毛细胞的位置。 采集耳蜗，制作铺片，利用免疫荧光染色和共聚焦显微镜的三维重建技术，观察耳 蜗内表达EYFP的细胞，并分析其与毛细胞和支持细胞的关系，使EYFP阳性细胞 的细胞类型得到进一步确定。 二、分析新生小鼠耳蜗支持细胞在失去Rb作用后的增殖潜能。 重组酶介导的肋基因敲除。 (2)检测耳蜗支持细胞失去Rb作用后是否重新进入了细胞周期。①接受过 对其进行BrdU或EdU的腹腔注射，以标记此时重新进入细胞周期的耳蜗支持细 胞。②通过免疫荧光染色(适用于BrdU)或共价叠氮反应(适用于EdU)，并结 合毛细胞或支持细胞特异性标记蛋白的双重荧光染色，检测重新进入细胞周期的耳 蜗支持细胞。③在Proxl．Rb乒耳蜗顶、中、底回的相应位置，分别对BrdU阳性支 持细胞进行计数统计。④将Proxl-Rb乒耳蜗内增殖性的支持细胞分布，与Proxl． CreERre小鼠耳蜗内Cre重组酶的分布情况进行比较与分析。 (3)检测耳蜗支持细胞失去Rb作用后是否可以完成细胞周期并增殖。①检测 表达情况，以研究通过限制点和S期的Proxl．Rb乒耳蜗支持细胞能否进入M期。 5 被复制状态)的双重染色，以研究重新进入细胞周期的支持细胞是否可以完成有丝 耳蜗支持细胞是否具有多次进入细胞周期的潜能。④通过外指细胞和柱细胞的计数 统计，以研究失去Rb作用的耳蜗支持细胞是否真正产生了增殖反应。 三、研究Rb基因缺陷的耳蜗支持细胞在增殖后的分化和存活情况。 小鼠耳蜗进行TUNEL染色，以检测最早出现凋亡的时间和支持细胞亚型。②在P9 解肠基因缺陷的支持细胞凋亡情况。③对不同日龄Proxl-Rb乒小鼠耳蜗铺片进行 My07a或My06免疫荧光染色，以检测毛细胞数量是否受到影响。 (2)研究鼢基因缺陷的耳蜗支持细胞在增殖后的细胞分化命运。①分别在 色，以检测Rb基因缺陷的支持细胞在增殖过程中的分化命运。②研究在耳蜗内出 现继发性毛细胞丢失的情况下，其分化是否会受到影响，探讨如何对哺乳动物耳蜗 支持细胞进行适当的调控，可以使其对毛细胞再生发挥最大的潜能。 主要结果如下： (1)新生的Proxl．CreERreb鼠耳蜗支持细胞可定向诱导Cre重组酶活性。 小鼠耳蜗中Cre重组酶的活性局限于外指细胞和柱细胞内。而且，具有重组酶活性 27．23％4-1．12％，即具有Cre重组酶活性的支持细胞大多为外指细胞。 (2)Rb基因的敲除可引起耳蜗支持细胞重新进入细胞周期并增殖。 在Proxl．Rb乒小鼠耳蜗内，发现外指细胞和柱细胞部位有BrdU阳性细胞出 现。在毛细胞分布的位置有时也会发现B