rna干扰技术鼻咽癌细胞系中的应用.pdf

摘要 RNA干扰(RNA stranded 线虫，果蝇，斑马鱼，真菌及植物等生物体内。大于30个核苷酸 因表达，21—22 同时不会激活细胞内的干扰素。RNAi技术是研究基因功能、信号转 导通路和进行基因治疗的最具潜力的良好工具，特别是对病毒感染性 疾病和肿瘤的基因治疗而言，RNA干扰很有可能是一个突破口。 的蛋白产物LMPl是现在研究最多的被证实有促使细胞转化甚至恶 变的重要物质。bcl．2基因通过抑制细胞的凋亡从而在肿瘤的发生发 展中发挥着重要的作用。研究证实大多数鼻咽癌组织中有BCL．2蛋 白的表达，并且BCL。2蛋白能阻止由多种因素如抗肿瘤药和射线诱 导的细胞凋亡。 毒载体两种方法进行了RNA干扰技术在鼻咽癌细胞系中应用的初步 探索，首先利用绿色荧光蛋白和荧光素酶报道基因系统证实了鼻咽癌 鼻咽癌密切相关的基因作为靶点，利用RNA干扰技术选择性地沉默 这两个基因在鼻咽癌细胞中的表达，观察对鼻咽癌细胞生长的影响。 研究分为四部分，实验方法和结果如下： 和bcl一2的表达 PCR检测所有56例鼻咽癌组织中都存在EB病毒LMPlDNA， 且所有鼻咽癌来源的LMPl均在XhoI酶切位点处存在点突变，不 能被XhoI酶切。进一步对一例鼻咽癌组织中的LMPl、 个碱基的缺失，但鼻咽癌来源的LMPl中的重复序列是4个，和 源的LMPl之间确实存在着许多碱基变异。测序的结果为我们设计 siRNA的靶点提供了线索。 mRNA， 用。 RT-PCR和Western blotting显示5—8F和CNE—LMP1细胞表达 LMPl mRNA mRNA和蛋白，而所有的鼻咽癌细胞系都表达bcl。2 的靶基因提供了依据。 第二部分：体外转录合成siRNA的RNAi效应 fluorescent 利用绿色荧光蛋白(green 酶(Luciferase)报道基因系统证实体外转录合成的带9ntloop结构的、 两端为互补序列的49—50nt的发夹样RNA(smallRNA， hairpin RNA(shortinterference 因表达，说明在鼻咽癌细胞系中存在着RNA干扰现象。 经Western 的表达，而反义单链RNA没有阻断作用。 第三部分：构建表达siRNA的逆转录病毒载体并建立稳定转染 psRNAs的鼻咽癌细胞系 II酶切位点已经丢失，因此需要改建。采用两轮PCR的 游处的Bgl 方法以pSUPER．retro为模板扩增出H1．RNA shLMP序列和一个Bgl 粒改建成psLMP，测序结果表明H1．RNA pSUPER．retro能成功地在细胞内启动RNApol 其RNAi作用，两个点突变没有影响。 的序列和设计的序列完全相符，可以进行下一步的实验。 经Western 瞬时转染细胞，也检测不出RNA干扰效应；提示可能跟转染效率差 有关，瞬时转染很难看出内源性基因的RNAi效应。 17细胞中，通过嘌呤霉素筛选得 将psLuc或psGFP转染入PA3 到阳性克隆，汇合后扩大培养，然后将培养的上清液感染已转染pGL3 的Hela细胞，48小时后检测发现荧光素酶的活性没有受到抑制。而 1 说明PA3 培养液中，但由于病毒滴度低的原因，不能有效地感染其他细胞，发 IIl 挥其RNAi作用。 细胞系，PCR证实细胞内含有psRNAs，Western 不表达LMPl，而 CNE—LMPl．psLMP和CNE．LMPl．psLl 未获得阳性克隆，可能该细胞系不适合用脂质体转染。 实细胞内含有psRNAs，Westem 不受