hiv-1ne通过erk mapk信号途径促进内皮细胞黏附分子icam-1的表达.pdfVIP

内 容 摘 要 目的：HIV/AIDS 以发展迅猛、死亡率之高，已成为21 世纪人类灾难性的疾病。 研究 AIDS 的发病机制和治疗方法已迫在眉睫。因此本实验研究HIV-1 的调节基因 Nef 对ECV304 细胞ICAM-1 表达的影响及其信号途径，从而分析HIV-1 感染引起内 皮细胞ICAM-1 高表达的原因，阐明Nef 参与HIV-1 致病的分子机制，为HIV-1 感 染的临床治疗提供实验基础。 方法：1）PCR 方法从HIV-1 HXB2 质粒中扩增HIV-1 Nef 基因，构建真核表 达载体pcDNA 3.1(+)-Nef 。2 ）将pcDNA 3.1(+)-Nef 和pcDNA 3.1(+)质粒（阴性对照） 分别转染血管内皮细胞ECV304 ，应用G418 筛选，获得稳定表达的细胞株。通过逆 转录聚合酶链反应（Reverse transcription-polymerase chain reaction ， RT-PCR ）、蛋 白质印记（Western blot ），细胞免疫荧光方法鉴定Nef 蛋白的表达。3 ）应用实时定 量PCR （ real-time PCR ）、Western blot 、流式细胞术（Flow cytometry ，FCM ），细 胞黏附试验分析ECV304-Nef 细胞ICAM-1 的表达水平。4 ）用Western blot 、FCM 技 术分析信号分子的磷酸化水平与Nef 诱导细胞ICAM-1 表达的相关性。 结果：1）质粒构建成功：构建的重组质粒pcDNA3.1(+)-Nef 经BamHI 和EcoRI 双酶切鉴定，得到的片段大小与理论值相符，分别为5400 bp 和621 bp；测序结果显 示的碱基序列与基因Bank (Gene Bank Accession No. K03455)序列相同。 2 ）建立稳定表达细胞株：转染细胞经G418 筛选后获得稳定表达Nef 的ECV304 细胞株：RT-PCR 示转染pcDNA 3.1(+)-Nef 质粒的ECV304 细胞出现621bp 条带（Nef mRNA 的表达），对照组无目的条带出现；荧光显微镜下观察转染pcDNA 3.1(+)-Nef 质粒的 ECV304 细胞表达的 Nef 蛋白定位于细胞质中；Western blot 结果见转染 pcDNA 3.1(+)-Nef 质粒的 ECV304 细胞约 27kD 处检测到目的条带，表明 pcDNA3.1(+)-Nef 表达正确。 3 ）Nef 表达细胞诱导 ICAM-1 高表达：RT-PCR 、real-time PCR 分析显示 ECV304-Nef 细胞 ICAM-1 mRNA 表达水平为对照组4.3 ±0.2 倍；细胞黏附实验观 察到ECV304-Nef 细胞黏附的Jurkat 细胞数明显多于对照组，荧光仪定量分析各孔细 胞的荧光强度结果显示： ECV304-Nef 细胞黏附的Jurkat 细胞的荧光强度值显著高与 对照组（P0.05 ）；Western blot 结果示ECV304-Nef 细胞ICAM-1 蛋白的表达水平高 于对照组；流式图显示ECV304-Nef 细胞和ECV304 pcDNA 3.1(+)细胞ICAM-1 阳性 细胞百分率分别为35.3 ±2.2%和 12.5±0.8% （P0.01 ），两组间ICAM-1 表达有显著 差异。 4 ）ERK 的磷酸化介导Nef 的生物学活性：Western blot 结果示与对照组细胞相 II 比，ECV304-Nef 细胞ICAM-1 与p-ERK 的蛋白水平均明显上调。加入p-ERK 抑制 剂后，ECV304-Nef 细胞p-ERK 水平被显著抑制，与对照组的p-ERK 水平无明显差 异，反映抑制剂抑制了Nef 上调的p-ERK 活性。在同一细胞内检测ICAM-1 水平时 发现ECV304-Nef 细胞的ICAM-1 也降至与对照组细胞相当的水平。FCM 结果显示 加入p-