第酵母基因工程基因工程原理与技术刘志国课件精要.ppt

作为宿主细胞的酵母需满足的基本要求 ①安全无毒，没有致病性。 ②遗传背景清楚，容易进行遗传操作。 ③外源DNA容易导入宿主细胞，转化效率高。 ④培养条件简单，容易进行高密度发酵。 ⑤有较强的蛋白质分泌能力。 ⑥有类似高等真核生物的蛋白质翻译后的修饰加工能力。 第一节 酵母基因工程表达体系--------载体 酵母菌转化方法 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 整合型重组巴斯德毕赤酵母的构建 PARS2 Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 Bgl II pBSAG151 11 kb Bgl II 5’ AOX1 HBsAg PHIS4 3’ AOX1 his+的转化子 重组分子 转化his-的受体细胞 染色体DNA 产乙肝表面抗原的重组巴斯德毕赤酵母 由于巴斯德毕赤酵母染色体DNA上还拥有第二个乙醇氧化酶基因 AOX2，所以整合型重组菌仍能在含有甲醇的培养基上生长。 重组菌首先在含有甘油的培养基中培养，待甘油耗尽后，加入甲 醇诱导HBsAg表达，最终S蛋白的产量可达细胞可溶性蛋白总量的3% 在大规模的生产过程中，巴斯德毕赤酵母工程菌在一个240L的 发酵罐中培养，最终可获得90克22nm的HBsAg颗粒，足够制成 900万份乙肝疫苗。 小 结 酵母基因工程，是根据酵母密码子偏好从头设计后化学合成或者PCR扩增获得目的基因片段与载体DNA，经过体外酶切、连接和重组，然后采取适当的转化方法，将重组后的带有外源基因的载体DNA导入酵母细胞，并使其在酵母细胞内进行复制和表达，以达到预期的改变受体酵母细胞遗传特性或者获得基因工程表达产物的目的。主要研究内容包括目的基因克隆，确定合适的酵母基因工程受体菌与载体系统，采用相应转化方法以及转化子的筛选与表型鉴定，重组基因工程酵母中目标蛋白的诱导和表达。 利用酵母表达外源蛋白既可以在胞内，也可以分泌到胞外。 酿酒酵母和毕赤酵母已成为高等真核生物基因的优良宿主系统。针对不同的表达宿主菌开发了相应的表达载体。酿酒酵母表达载体有基于酵母基因组的复制起始区ARS或者酵母天然质粒2m复制起点序构建的游离自主复制型质粒载体，也有整合型载体。但是由于毕赤酵母表达载体上无酵母复制起点，它是靠同源重组将外源基因表达序列整合入受体细胞的染色体DNA上，构建稳定的毕赤酵母工程菌。 酵母菌基因转移方法有：原生质球法、电击转化法、PEG方法和Li+盐转化方法。 筛选方法主要是：营养缺陷型筛选和抗生素抗性筛选。 将来表达系统发展的方向是采用自克隆技术构建的食品级表达系统。宿主为食品级微生物，载体采用食品级选择标记，既不能有抗生素标记存在。通常以缺陷型菌株作为受体菌，载体上携带有受体菌所缺陷的基因与受体菌互补，作为选择标记。 思考题 1， 对作为表达目标蛋白宿主的酵母细胞有什么基本要求？ 2， 什么叫穿梭载体？指出酵母穿梭表达载体pYES2每个元件的功能。 3 ，毕赤酵母中三种表型Mut+， Muts，Mut- 分别代表什么含义，各种表型是怎么产生的？ 4 酿酒酵母和毕赤酵母表达载体中常用的启动子有哪些？哪些是诱导型的启动子？哪些是组成型的启动子？ 5， 比较酿酒酵母和毕赤酵母表达系统的优缺点。 6 ， 提高外源基因在酵母中的表达水平，考虑从哪些方面入手？ 酵母菌转化方法 原生质球法：酶解酵母细胞壁，产生原生质球，原生质体在Ca2+和PEG的存在下，具有穿透性，并允许DNA进入，然后使原生质球再生新的细胞壁。可以实现转化，转化子可达原生质体总数的1-2%。 Li+盐转化方法 ：酿酒酵母的完整细胞经碱金属离子（如Li+等）处理后，在PEG存在下和热休克之后可高效吸收质粒DNA。醋酸锂对酿酒酵母有效，对毕赤酵母无效，毕赤酵母转化一般用氯化锂有效 优点：吸收线型DNA的能力明显大于环状DNA（相差80倍） 电击转化法：原理是通过利用高压电脉冲作用，造成细胞膜的不稳定，形成电穿孔，形成可逆的瞬间通道，不仅有利于离子和水进入细胞，也有利于外源DNA等大分子进入 优点：不依赖于受体细胞的遗传特征及培养条件；适用范围广；转化率高（达105 / mg DNA）。 PEG转化法：PEG 1000 酵母细胞转化特点 单、双链DNA均可转化，但单链的转化率是双链的10-30倍 单链质粒进入细胞后，能转化为双链并复制（含有复制子）或 同源整合入染色体（不含复制子） 克隆在YIp上的外源基因，会发生高频同源整合，整合子占转化子总数的50-80% 用于转化子筛选的标记基因 营