四川省猪嵴病毒病流行病学调查及其间接ELISA抗体检测方法的建立.pdfVIP

中文摘要 ㈣姐脚1～ ㈣绁删7～㈣荨j『 猪嵴病毒(Porcine 嵴病毒；2009年，在中国猪群中也检出了猪嵴病毒。自此之后，多个国家报道在猪 群中检测到猪嵴病毒，包括泰国、臼本、韩国、荷兰、巴西、西班牙、意大利、东非 等。猪嵴病毒是一种具有传染性、在世界范围内广泛分布的新型病毒，在腹泻猪中有 较高检出率，认为可能是猪腹泻的病原，但鉴于其在没有腹泻的猪群中也普遍存在， 且目前尚未能实现体外分离培养，需要更多的研究来阐明其生物学特性及病原特性。 本研究旨在对四川地区猪嵴病毒病流行情况进行调查，并对四川株猪嵴病毒VPI 基因分子流行病学特点进行分析；VP]蛋白是嵴病毒暴露在最外面的结构蛋白，是嵴 病毒的优势免疫蛋白，本研究通过大肠杆菌表达系统，表达猪嵴病毒VPl蛋白优势 抗原表位区，利用纯化的重组蛋白建立一种检测猪血清中猪嵴病毒抗体的间接ELISA 方法，为今后猪嵴病毒血清学诊断方法的研究奠定基础。 本研究在2011．2012年从四川猪场中收集了163份猪粪便和肠道组织样品，其中 112份来自腹泻猪，51份来自没有腹泻的猪。利用RT-PCR方法对样品进行检测，猪 5／51)。利用SPSS (72／112)，采集自无腹泻猪的样品中，猪嵴病毒的感染率为29．4％(1 21．0软件对腹泻组数据和无腹泻组数据进行卡方检验，结果显示猪嵴病毒感染和腹泻 具有极显著相关性， 2=17．126，P=3．5×10一；在哺乳仔猪、保育猪、育肥猪和成年 母猪中，猪嵴病毒的感染率依次为：66．7％、39．1％、23．5％、40．0％，对四个年龄段 感染数据进行卡方检验，分析显示哺乳仔猪和猪嵴病毒感染具有极显著相关性，，= 10．941，P=9．4x10卅。腹泻猪和幼龄猪可能对猪嵴病毒更易感。 利用RT-PCR扩增猪嵴病毒VPl基因序列，通过分子克隆，测序得到35个猪嵴 5．0软件对猪嵴病毒VPl 80．7％一100％，氮基酸序列相似性为87．2％．100％。利用MEGA 基因序列进行系统进化分析，结果显示本研究获得的四川株猪嵴病毒分属于四个大的 分支，说明多株猪嵴病毒在四川地区流行，进化树显示猪嵴病毒VPl基因序列的分 群无明显地域性差异。通过序列分析，表明在两只猪的粪便样品中分别检出3株和2 株猪嵴病毒共同感染，首次为多株猪嵴病毒共感染提供了依据；通过重组分析软件 万方数据 A2序列的VPl区段可能是由于A1和A3之间发生重组产生的。重组事件的发生会 推动病毒基因组的进化，导致基因多样性的发生。 蛋白线性抗原表位，综合各种预测结果，选择抗原表位较集中、抗原指数较高的前半 段(1—462bp)作为猪嵴病毒优势抗原表位区，将选取的基因片段送公司进行密码子 优化后合成基因，将合成的基因片段定向克隆至原核表达载体pET32a(+)00，构建重 过对诱导条件进行优化，确定37。C，0．2mmol／LIPTG诱导表达4h为最佳诱导条件， 重组蛋白大小为35．6KDa，以可溶性形式存在，在Westernblot检测中，通过Ni柱纯 化的VPl重组蛋白和猪嵴病毒阳性血清存在特异性反应，说明重组蛋白具有良好的 抗原性。 利用纯化的重组蛋白作为包被抗原，初步建立猪嵴病毒抗体检测间接ELISA方 法，并对间接ELISA反应的各个条件进行优化，结果显示，抗原的最佳包被浓度为 1h+4℃过夜为重组蛋白最适包被条件， 2pedmL，血清最适稀释倍数为1：200，37。C 5％脱脂奶粉封闭90min为最适封闭液和封闭时间，待检血清温育时间为60min，酶 临界值为0．250。建立的问接ELISA检测方法具有较好特异性，与猪传染性胃肠炎病 毒、猪流行性腹泻病毒、猪轮状病毒、猪瘟病毒、猪-2td,病毒、猪繁殖与呼吸综合征 病毒6种常见猪病病原阳性血清无交叉反应。建立的方法具有较好的重复性，批内重 复性实验和批问重复性实验，变异系数均小于10％。用建立的间接ELISA方法，对 170份猪血清样本进行检测，结果显示65份血清为猪嵴病毒抗体阳性，阳性率为 38．2％。本研