大鼠骨骼肌挫伤复过程中nrf1和nrf2表达及分布的研究.pdfVIP

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大鼠骨骼肌挫伤复过程中nrf1和nrf2表达及分布的研究

·中文论著摘要· 大鼠骨骼肌挫伤修复过程中Nrfl和Nrf2 表达及分布的研究 刖 吾 骨骼肌在人体内分布广泛,在法医检验鉴定工作中,我们经常遇见骨骼肌挫 伤的案例。在骨骼肌挫伤之后,骨骼肌损伤愈合过程也会随之开始。骨骼肌损伤 愈合过程包括:炎症、增殖和修复。在整个损伤愈合过程中有大量的炎症因子、 细胞因子和化学介质等参与其中,这些因子的表达直接或间接的对骨骼肌损伤愈 合起着重要的作用。目前法医学上针对骨骼肌损伤愈合过程中各种因子或介质的 研究报道很少,所以我们的研究就从这方面出发,对于骨骼肌损伤愈合过程中相 关因子的表达做一初步探讨。 Nffs nuclear 2 subunit—related p45 factor-erythroid collar 家族成员,是具有高度保守的碱性亮氨酸拉链 bZIP 结构的转录因子。 多种细胞型中。 在氧化应激情况下,Nrfl和Nrf2都可以进入细胞核内和抗氧化反应元件 ARE 结合,调节多种抗氧化基因的表达,从而对于机体的氧化损伤具有重要 的保护作用。另外近年来的实验研究显示Nrfl对于哺乳动物的生长发育、肝脏保 护以及骨骼发育都起着重要的作用。敲除Nrfl的小鼠胚胎会因为肝脏造血异常导 致贫血死亡。Nrf2对于呼吸系统疾病、肿瘤的发生具有保护作用,同时还有肝脏 保护、神经保护、细胞保护等功能。但是,Nrfl和Nm是否参与骨骼肌挫伤愈合 过程的调节,目前国内外还尚未见研究报道。 本课题成功的建立了大鼠骨骼肌挫伤动物模型,并联合应用了免疫组化、荧 PCR及Western 光双染、real.time blot等技术对标本进行检测,旨在探讨: 1 Nrfl和Nrf2的表达分别随时间规律性的变化,是否有可能应用于法医学中骨骼肌 损伤时问的鉴定; 2 骨骼肌挫伤过程中Nrfl和Nrf2表达在多种细胞类型的具 体位置以及表达时间等,来深层探讨两因子在骨骼肌挫伤愈合过程中的作用,探 索骨骼肌挫伤愈合过程的新机制,为进一步阐明骨骼肌挫伤愈合的分子机制奠定 基础,为今后法医学中研究骨骼肌损伤愈合提供新的途径和方法,并为法医学在 骨骼肌损伤时间鉴定方面提供新的方法。 材料与方法 1、骨骼肌挫伤动物模型的建立 其中骨骼肌挫伤分为8个时间段组,另一组为正常对照组,每组均为5只大鼠。 腹腔注射戊巴比妥钠麻醉后,后肢剪毛备皮。将大鼠后肢置于伸膝、踝背屈900 位置,用自制打击器 重500克 打击大鼠右下肢距跟骨2.5cm处,打击处做好 标记。伤后肌肉仍保持完整,胫腓骨无骨折,不给予任何处理。伤后每只单独饲 养,给予饲料及自来水,保持挚料清洁及空气通畅。分别于伤后6h、12h、ld、 3d、5d、7d、10d和14d向大鼠腹腔内注射过量戊巴比妥钠致死,取挫伤处骨骼 肌组织,正常对照组大鼠麻醉后背部剪毛,不做挫创,观察至14d,注射过量戊 巴比妥钠致死,取相同部位同等大小肌肉。各组5只大鼠的肌肉样本被均分为两 部分,一部分用于石蜡切片进行HE染色、免疫组织化学染色和免疫荧光染色, 另一部分用于Westernblot和real.timePCR检测。 2、组织化学和免疫组织化学染色 7.4 固定12h,脱水、透明,包埋在石蜡 所取肌肉样本经4%多聚甲醛 pH 中,制作5pm厚度连续切片,进行HE染色及Nrfl、Nrf2的免疫组化染色。 3、免疫荧光染色 4、Western Blot检测Nrfl和GAPDH蛋白 提取样本总蛋白,上样量为50ug,转印到PVDF膜上后用5%脱脂奶粉封闭, 2 4℃孵育过夜,分别用相应的二抗孵育,ECL显影,胶片中的蛋白条带经 Biolmagingsystems采集后进行灰度值测定。目的蛋白灰度值与内参GAPDH灰度 值的比值作为相对表达量。 5、实时定量多聚酶链反应 real.time mRNA 用Trizol Reagent提取肌肉样本的总RNA。紫外可见光分光光度计测定 RT Kit说明,进行反转录反应。应用 冰箱保存备用。按PrimeScriptTMreagents 7500Real-TimePCR AppliedBiosystems System,采用标准程序两步法进行PCR扩 增,并通过一个循环采集荧光信号,绘制融解曲线。 6、统计学分析 用SPSSl3.0 实验结果 一、挫伤后形态学改变 cells,PMNs 伤后6h,挫伤处骨骼肌可见多形核细胞 polymorphonuclear 浸润。伤后12h,聚集在挫伤区PMNs和圆形的单个核细胞 mononuclearcells, MNCs 进一步增多。伤后1d,以MNCs为主。伤后3d,MNCs和纺锤形的成 纤维样细胞 fibroblastic my

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