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与黄瓜霜霉病抗性相关基因连锁的分子标记研究 　　摘 要：以黄瓜抗霜霉病和感霜霉病亲本组合（Q9×Q10）的F2分离群体为试材，采用BSA法筛选到了1个AFLP引物组合P11M70在抗病池和感病池间表现多态，抗病池和抗病亲本均具有大小约304 bp的特异谱带，感病池和感病亲本均扩增出了大小约为301 bp的特异片段。经F2单株验证及连锁分析，该特异片段与霜霉病抗病相关基因相连锁，连锁距离为5.22 cM。对特异片段的测序结果显示，两片段的大小分别为304 bp和301 bp，且2个片段的差异仅为3个“A”碱基的插入或缺失以及1个“C-T”的碱基突变。将该AFLP标记成功地转换为了简单实用的SCAR标记。 　　关键词：黄瓜；霜霉病；抗性相关基因；分子标记 　　黄瓜霜霉病是黄瓜三大主要病害之一，流行年份可导致黄瓜减产达30%～50%。应用抗病品种防治植物病害是最为经济、安全、有效的途径。以往抗病品种的选育主要采用常规育种技术，对材料抗病性的鉴定依靠田间鉴定方法，受环境因素影响较大，鉴定结果也不够准确，即便是采用人工接种抗病鉴定技术，也由于其病原菌活体寄生的原因而受到季节限制。分子标记技术的飞速发展，为利用与目标基因紧密连锁的分子标记进行性状鉴定提供了一条新途径。 　　目前关于黄瓜霜霉病的分子标记研究已有部分报道。丁国华等[1]找到了1个RAPD标记，与黄瓜霜霉病抗性基因之间的连锁距离为7.85 cM。白智龙等[2]分春秋两季进行了黄瓜霜霉病抗性QTL的检测，共检测到3个QTLs，其中贡献率最大的1个QTL在春秋两季的贡献率分别达到了36.4%和27.3%。张素勤等[3]筛选到了1个与控制黄瓜霜霉病某个感病基因连锁的AFLP标记，该标记解释霜霉病抗性表型变异的11.34%。但上述文献所报道的分子标记与黄瓜霜霉病抗性基因间的遗传连锁距离均较远，用于黄瓜霜霉病抗性辅助育种尚有较大误差。 　　本研究分别以高抗和高感黄瓜霜霉病的2个材料为亲本，配制F2分离群体，采用苗期人工接种抗病性鉴定技术和田间抗病性直接鉴定方法，对F2分离后代的抗性进行了鉴定；同时，结合BSA法（分离群体混合分析法）采用AFLP技术，筛选与黄瓜抗霜霉病性状基因相连锁的分子标记，为利用分子技术进行黄瓜抗霜霉病辅助育种以及霜霉病抗性基因的克隆奠定基础。 　　1 材料与方法 　　1.1 试验材料 　　供试材料为高抗和高感黄瓜霜霉病的黄瓜高代自交系Q9、Q10及其F2分离后代。AFLP引物购自上海生工生物工程公司。 　　试验于2002-2004年在天津科润农业科技股份有限公司黄瓜研究所完成。 　　1.2 试验方法 　　①抗性分离群体的构建及黄瓜霜霉病抗病性鉴定 将供试材料播种于塑料温室中，常规管理。采用喷雾法于3片真叶期进行霜霉病苗期人工接种抗性鉴定。采用吕淑珍等[4]所述的分级标准，分别于接种后7、14、20 d左右调查霜霉病的发病情况。 　　②DNA的提取 选取高抗霜霉病和高感霜霉病的F2单株各5株，组成抗病池和感病池。分单株提取DNA和PCR扩增。DNA提取采用CTAB法[5]。 　　③AFLP分析 参照Vos等[6]的方法进行AFLP分析。采用MseI和PstI 2种内切酶进行基因组DNA的酶切；预扩增引物不含选择性碱基。 　　③引物筛选及分子标记的验证 对抗、感亲本及抗、感池内各单株进行PCR扩增，将在抗感亲本间及抗感两池间同时产生差异谱带的引物组合，作为与黄瓜霜霉病抗性相关基因连锁的候补引物组合；然后利用F2单株对候补引物组合进行吻合性验证。 　　⑤特异片段的测序 特异片段的回收纯化参照张桂华[5]的方法。序列测定由大连宝生物公司进行。 　　⑥SCAR标记引物的设计与PCR扩增 根据测序结果以及引物设计的原则，用primer 3.0软件设计特异性引物。SCAR扩增条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min， 58℃退火1 min，72℃延伸2 min，35个循环；然后72℃延伸7 min。 　　2 结果与分析 　　2.1 F2分离群体黄瓜霜霉病抗性的鉴定 　　根据分级标准将134个F2单株分为抗病、中间类型和感病3个级别，其中抗病单株27株，感病单株32株，中间类型75株，适合性测验分析显示，基本符合1∶2∶1的分离比例（表1）。表明在本试验所采用的供试材料的遗传背景下，黄瓜对霜霉病的抗性是由单隐性基因控制的，且中间类型单株田间表现偏向于感病亲本，感病相对抗病为显性且为不完全显性。 　　2.2 与黄瓜霜霉病抗病基因相连锁的分子标记的筛选 　　筛选到76对在双亲间具有多态性的引物组合，其中共显性AFLP标记（P11M70-304 bp/301 bp）在抗病池和感病池之间也具有相同的多态性。抗病亲本和抗病池单株都具有304