乙型肝炎病毒hx蛋白与肝细胞蛋白的相互作用及对其功能的影响.pdf

乙型肝炎病毒HBx 蛋白与肝细胞蛋白 的相互作用及对其功能的影响 摘要 乙型肝炎病毒 (Hepatitis B virus, HBV)感染可引起急慢性乙型肝炎、肝硬 化，并与原发性肝细胞癌发生、发展关系密切,但其具体致病机制尚不十分清楚。 HBV 基因组长约3.2kb ，为部分双链环状DNA ，含有4 个开放读码框（open reading frame ，ORF ），即：S 区、C 区、P 区、X 区。HBx 蛋白是由HBV 基因 组X 开放读码框编码的长度为 154 个氨基酸的蛋白，大小为 16.5kDa。HBx 具 有多种功能，在HBV 致病过程中发挥重要作用，是HBV 最重要的致病因子之 一。本研究利用 CytoTrap 酵母双杂交方法筛选与 HBx 蛋白相互作用的肝细胞 蛋白，进一步在体内外确定HBx 蛋白可以与ECSIT 和VCP 发生相互作用，并 探讨HBx 蛋白对ECSIT 和VCP 功能的影响，最后探索其致病机制。 本研究第一部分利用 CytoTrap 酵母双杂交方法筛选与 HBx 蛋白发生相互 作用的肝细胞蛋白。为此，构建了用于CytoTrap 酵母双杂交的pSos-HBx 诱饵 载体并证实其在酵母中可表达Sos-HBx 融合蛋白。在确定Sos-HBx 在CytoTrap 酵母双杂交系统中无自激活作用基础上，以pSos-HBx 筛选并得到30 种与HBx 相互作用的肝细胞蛋白，即：MYPK 、TCTP、EKI1 、ECSIT 、MRLC2 、VCP 、 USP15 、PSMC1 、PSMD4 、YWHAH 、FN1 、NACA 、MPP6 、GSTO1、TOMM70A、 ORM2、ITIH3 、SF3A3、PREPL 、PTPRA 、SMARCC1、BRWD2 、CP、ETNK1 、 PPM1A 、LSM8 、AMACR 、AFM 、IQWD1 、RBX1 。 本研究第二部分通过 GST pull-down 实验和免疫共沉淀实验 （Co-Immunoprecipitation,Co-IP ）进一步证实了 HBx 蛋白可以与 ECSIT （evolutionarily conserved signaling intermediate in toll pathways ）及含缬酪肽蛋 白（valosin-containing protein ，VCP ）在细胞外和细胞内存在相互作用。并且利 用CytoTrap 酵母双杂交技术确定了HBx 蛋白的第51~80 氨基酸介导与ECSIT 的相互作用，第51~120 氨基酸介导与VCP 的相互作用。 6 本研究的第三部分旨在探讨HBx 蛋白对ECSIT 或VCP 相关功能的影响。 利用萤火虫荧光素酶报告实验表明，HBx 蛋白可以促进ECSIT 或VCP 所介导 的NF-κB 激活作用。提示HBx 通过与ECSIT 或VCP 的相互作用，参与了HBV 的致病性。 关键词：乙型肝炎病毒; CytoTrap 酵母双杂交；清道夫信号通路进化保守的中 间因子；含缬酪肽蛋白 7 Influences of hepatitis B X protein （HBx ）on hepatocyte proteins through protein-protein interactions Abstract Hepatitis B virus (HBV) infection results in acute, chronic hepatitis, cirrhosis of the liver and closely associated with hepatocellular carcinoma (HCC) ，yet the exact molecular mechanism is not very clear. HBV has a ge