中华眼镜蛇毒对acat细胞增殖和凋亡的影响.pdfVIP

1 目 录 原创性声明和授权书1 目录错误!未定义书签。 摘要错误!未定义书签。 Abstract4 引言错误!未定义书签。 实验材料与方法9 结果16 讨论26 小结32 结论错误!未定义书签。 参考文献错误!未定义书签。 致谢36 综述37 2 中华眼镜蛇毒对HaCaT 细胞增殖和凋亡的影响 摘要 目的：通过使用中华眼镜蛇毒干预体外培养的人角质形成细胞 (HaCaT细胞)，检 测对其增殖和凋亡的影响以及可能机制，以探索其用于治疗银屑病的可能性，为 下一步的体内实验以及临床实验运用于合理、有效治疗银屑病提供实验依据。 方法：①角质形成细胞 HaCaT 的培养和传代。②Cell Counting kit-8 法确定蛇 毒对 HaCaT 细胞的适用剂量及对其体外增殖的影响。③倒置光学显微镜观察正常 组及凋亡细胞形态。④Annexin Ⅴ/PI 双染色法检测蛇毒不同浓度及不同干预时 间细胞凋亡率的比较和变化，分别用倒置荧光相差显微镜观察及流式细胞仪测定 凋亡坏死率。⑤分光光度法检测不同蛇毒浓度作用时 caspase-3 、caspase-8 和 caspase-9 的活性变化。 结果：①.角质形成细胞 HaCaT 在光学显微镜下形态学观察显示细胞呈典型上皮 样特征，贴壁后呈“铺路石”状。②CCK-8 法中，浓度为 1、2、4、8、16 和 32 μg/ml 蛇毒分别作用 24h、48h 和 72h 后，与对照组相比，眼镜蛇毒能抑制 HaCaT 细胞的增殖 (P0.05)，且抑制率升高具有浓度和时间依赖性。③倒置荧光相差显 微镜观察凋亡细胞形态显示凋亡晚期细胞可同时被 Annexin Ⅴ和 PI 双染，光镜 显示细胞呈现典型的凋亡细胞形态学改变,每高倍显微镜视野下凋亡细胞的数量 随蛇毒浓度的增加明显增多，且多见凋亡晚期的细胞。流式细胞仪测定 HaCaT 细胞均显示与对照组相比凋亡坏死率随着浓度增高及作用时间延长升高 (P0.05)。④分光光度法检测不同蛇毒浓度作用时 caspase-3 和 caspase-9 的 活性随着蛇毒浓度的升高有明显增加，与对照组相比以及两两相比，P0.05，差 异具统计学意义；随着蛇毒浓度增大，相同时间干预后 Caspase-8 活性无明显变 化，P0.05，差异无统计学意义。 结论：1、中华眼镜蛇毒能在体外抑制 HaCaT 细胞的增殖。2、中华眼镜蛇毒可诱 导HaCaT 细胞的凋亡坏死，且以晚期凋亡和坏死为主。3、caspase-3 和 caspase-9 在中华眼镜蛇毒诱导HaCaT 细胞的过程中活性出现升高，Caspase-8 的活性升高 不明显，提示主要为线粒体凋亡途径参与了诱导凋亡的进程。 关键词：中华眼镜蛇毒，HaCaT 细胞，银屑病，细胞凋亡 3 Effects of Naja Naja Atra Venom (NNAV ）on the proliferation and apoptosis of a human keratinocyte cell line HaCaT Abstract Objecfive :In this study,the effects of Naja Naja Atra Venom (NNAV）on proliferation, apoptosis and the possible apoptosis mechanism of a human keratinocyte cell line HaCaT were investigated,which could provide theoretical basis for the next in vivo study and clinical trial to explore the possibility of topical application in the treatment of psoriasis. Methods：①HaCaT cells were cultured and subcultured.②Cell counting k