人汗腺细胞及其导多能性干细胞的生物学特征鉴定.pdfVIP

指导小组成员 秦明德 副教授 1 人汗腺细胞及其诱导多能性干细胞的生物学特征鉴定 中文摘要 中文摘要 排汗是皮肤的重要功能之一，皮肤通过排汗来维持基础代谢体温。汗腺是皮 肤的一个附属机构，是排汗的承担者，没有汗腺的皮肤如疤痕等不能排汗。随着 医疗卫生改革和居民生活水平的提高，大面积深度烧伤病人存活率越来越高。大 面积深度烧伤病人的烧伤面积可达 98%，病人伤愈后，在创面形成疤痕组织，而 疤痕组织不含有汗腺，不能排汗，大大影响了病人的生活质量。如何再生足够量 的汗腺，使病人皮肤排汗功能修复，是临床上亟待解决的问题。 由于大面积深度烧伤病人的烧伤面积很大，不可能从病人身上取得大量的汗 腺细胞，所以汗腺细胞的来源很少，并且汗腺细胞是体细胞，在体外难以实施扩 增培养。所以本论文旨在通过体外分离获得人汗腺细胞，继而构建人汗腺细胞来 源的iPS ，为获得大量的修复汗腺的种子细胞奠定基础。 第一部分 人汗腺细胞的分离、体外培养及鉴定 目的：从外科手术废弃的幼儿六指皮肤中分离获得汗腺细胞，建立体外培养 传代方法，并对其生物学特性进行鉴定。 2 方法：将幼儿六指皮肤除去脂肪和结缔组织，剪成1mm 大小，用IV 型胶原 酶于37℃消化4h，在倒置显微镜下提取出汗腺。将汗腺干贴于6cm 细胞培养皿中， 加入汗腺细胞培养基于37℃、5%CO 细胞培养箱中培养。2-3d 后，细胞从汗腺中 2 长出。RT-PCR 和免疫荧光染色技术检测汗腺细胞的标志基因和蛋白质CEA、CK14 和CK18 的表达。 结果：人汗腺细胞呈典型的上皮细胞样生长，排列紧密，类似铺石路状，细 胞边界明显，核清晰；RT-PCR 和免疫荧光染色技术结果显示，分离培养的细胞表 达汗腺细胞的标志基因和蛋白CEA、CK14 和CK18 。 结论：成功建立人汗腺细胞的分离和体外培养体系，并对其生物学特性进行 初步鉴定，为进一步研究汗腺细胞奠定了物质基础。 关键词：汗腺；汗腺细胞；CEA I 中文摘要 人汗腺细胞及其诱导多能性干细胞的生物学特征鉴定 第二部分 人汗腺细胞来源的iPS 制备及生物学特性鉴定 目的：重编程人汗腺细胞为诱导多能性干细胞，并对其生物学特性进行初步 分析。 5 方法：取体外培养 10d 后的汗腺细胞，以 1×10 的密度接种于6cm 细胞培养 皿中。第二天，加入含有4 种胚胎干细胞的转录因子基因Oct4、Sox2、Klf4 和c-Myc 的慢病毒的无血清培养基。2-3d 后，消化接种到铺有滋养层细胞的6cm 细胞培养 皿中，培养约10d 后，挑选克隆和细胞形态与hESC 相同的克隆，接种于铺有滋养 层细胞的24 孔板中。培养约 10d 后，再次挑选克隆和细胞形态与hESC 相同的克 隆，接种于铺有滋养层细胞的6 孔板中。RT-PCR 检测诱导后的细胞Oct4、Sox2、 KLf4 、c-Myc 和Nanong 基因表达，免疫荧光技术分析4 因子转染细胞对hESC 标 志物Oct4、SSEA-3、SSEA-4 、TRA-1-60 和TRA-1-81 的表达。 结果：（1）人汗腺细胞经慢病毒转染后细胞形态改变，与汗腺细胞差异显著， 形成的iPS 克隆，形态与hESC 形态相似，细胞生长紧密，边界不明显，核质比高， 核仁清新，在细胞周围有大量代谢产物；（2 ）RT-PCR 显示汗腺细胞来源的iPS 表 达基因 Oct4、Sox2、KLf4 、c-Myc 和Nanog ；（3 ）免疫荧光技术显示汗腺细胞来 源的iPS 的Oct4、SSEA-3、SSEA- 4 、TRA-1-60 和TRA-1-81 蛋白质表达呈阳性。 结论：人汗腺细胞经4 因子转染后，成功构建iP