人生长激素基因腺特异性表达载体的构建及羊胚成纤维细胞的建立.pdfVIP

人生长激素基因乳腺特异性表达藏体的构羹及其 羊胚成纤维细胞系的建立 硕士研究生： 王晓斐 指导教师： 杨佩满教授 指导小组： 马都芳副教授 专业名称： 人体解剖与组织胚胎学 摘 要 玄、》墨垢 Do Lly羊的诞生使人们认识到在动物乳腺生物反应器研制中核移植 技术具有受精卵显微注射所不及的一些独特的优势，使核移植技术不 但具有重大的理论意义，而且具有巨大的应用前景。而如何把核移植 技术应用于动物乳腺生物反应器的研制上，从而达到生产蛋白质药物 的目的，已成为继微生物和真核细胞之后高效表达目的蛋白质的新一 代基因工程研究的热点。目前，研制乳腺生物反应器的路线有很多， 为了提高乳腺生物反应器研制的成功率，我们采取了转基因克隆动物 的技术路线。本文阐述了我们建立的转人生长激素基因(hGH)胚胎成 纤维细胞系的过程。首先，我们把乳球蛋白基因启动子(BLG)和人生长 BLG启动子(乳 激素基因fhGH)连于pLNCX载体，具体过程如下： 球蛋白启动子)用BamHI酶切后，补平，连到PUCl8上，设计引物 经PCR反应证实BLG插入方向的正确性，然后把mtf-hHG质粒用 EcoRI酶切，补平，再用BamHI酶切，这样使得到的hGH基因一端 是平末端，另一端是BamHI粘性末端，这样就可以连到经BamHI和 8上，经酶切和PCR以及DNA测序以证明BLG 卜ijncII酶切的PUCl 启动子和hGH基因插入方向及序列的准确性，然后再用 的人生长激素基因连到pLNCX上，这样就以BLG启动子代替Pemv 启动子来调控下游生长激素基因的表达，经PCR证明插入的正确性。 的新霉素抗性基因，利用这一特性即可用G418来筛选所需要的细胞。 我们利用受精后35天的羊胚培养了成纤维细胞，在第二代利用脂质 体转染羊胚成纤维细胞，转染后第三天通过G418进行筛选，筛选后9 天，把单克隆细胞移入96孔板中，长满后移入24孔板中，最后移入 培养瓶中，进行传代，现已传9代。通过PCR检测得到一个具有新霉 素抗性的整合有人生长激素基因(hGH)的稳定表达的细胞克隆，为以 后用该细胞系进行核移植研制克隆动物打好基础。并且因为BLG已 经被证明在牛乳中有理想的表达水平，那么我4f]就可以从转基因克隆 动物乳汁中得到高产量的蛋白质药物。并且我们可以在核移植之前随 时对培养细胞进行修饰，这样就能得到一个优于原核显微注射的替代 方法。 关健词：人生长激素基因乳腺特异性载体脂质体转染萃胚成纤 维细胞系建立 onofhRH i fi C i amauary—spec Theconstruot of i0 I i shmnt e8t-b embryon and veotor i011 express I ino OelI fibrobIast ofthe Clearly ofthebirth sheep，Dolly，researchers Because more