人胚胎干细胞体诱导分化为心肌细胞的实验研究.pdf

人胚胎干细胞体外诱导分化为心肌细胞的实验研究 中文摘要 第一部分 研究目的： stemcellsMSCs)的分离和培养，通过 观察太鼠骨髓间充质卜细胞(Mesenchymal 适的的诱导浓度。 研究方法： 抽取大鼠骨髓，采用贴壁培养法分离MSCs，进行培养、传代，在第4代MSCs 中添加诱导荆5氯胞苷(5-aza)对其进行诱导分化，其浓度分别为：0“mol／L、 10amoI／L、30amoFL，观察细胞形态学的变化，荧光免疫组织化学方法进行鉴定。 研究结果； 鼠MSCs，lOd后细胞之间出现连接，排列方向渐趋一致，有肌管形成，部分细胞则死 亡。诱导28d后，细胞变稀，周围伸出多个长的突起，细胞形态大小不一。而加入 5 终浓度为30“mol／Laza—dC的MSCs，在诱导后第5d，细胞则全部死亡。 结论： 大鼠MSCs体外在5一氮胞苷作用下可定向分化为心肌样细胞。 第二部分 研究目的： factorHGF) 探讨5-氮胞苷(5-aza—dC)、肝细胞生长因子(Hepatoc)tegrowth stemcell 作为诱导剂，体外诱导人类胚胎干细胞(Human hESC)分化为心 embryonic 肌细胞的昂佳诱导分化浓度。 研究方法： 1．将传代的hESC(PKU．1．1)接种到低粘附六孔板中进行悬浮培养形成拟胚体 Bodies EBs)。7d后，分别将EBs接种到四孔板中贴壁培养，分别以 (Embryonic 5-aza．dC、HGF为分化诱导剂加入分化培养基中，组合成几种分化培养基，分别为 发搏动的EBs的数量，计算各组分化成功的EBs数， 2．光镜动态观察细胞形念学的变化，荧光免疫组织化学，RT-PCR以及电镜方法对 分化细胞进行鉴定。组问比较用方差分析及t检验．以pO．05，为差异有显著性， 比较各组之间的分化比率。 研究结果： T及Connexin43的表达呈阳性，并町见清 2．5-5／Mmol／L为最佳诱导浓度。Troponin 晰肌小节。RT—PCR检测MLC-2A、MLC-2V、hANP、IB-Actin mRNA表达阳性。电 镜下可见细胞内有肌节样结构。细胞分化率比较：2．5“mol／L、瓤mol／L组之间无明 组之间也没有明显差异(p0．05)。而20舭moI／L组的细胞大部分出现死亡。 向心肌细胞分化，TroponinT及Connexin43的表达呈阳性，并可见清晰肌小节。 mRNA 显高于lng／ml、30ng／ml组(p0．05)。 结论； 5-aza—dC效果最理想；5ng／ml一10ng／ml的HGF为最佳浓度区间。 硕士研究生：郭敏芳(免疫学) 指导教师：李建远教授 关键词：骨髓间充质干细胞、胚胎干细胞、心肌细胞、5一氮胞苷、肝 细胞生长因子、细胞分化。 Differentiationofhuman stemcells embryonic into invitro cardiomyocyte Abstract Parlone Object