提高cpg寡核酸抗肿瘤作用的初步研究.pdf

提高CpG寡核苷酸抗肿瘤作用的初步研究 硕士研究生： 陈琰 指导教师： 张卓然 教授 专业名称： 病原生物学 摘 要 细菌的DNA能够激活抗原递逞细胞，促进其分泌IL．12，从而激 motif使其具有这种免疫 发Thl型免疫应答。细菌DNA中含有的CpG motif由6个碱基组成，其核心为非甲基化的CpG 激活的作用。CpG motif的合成 二核苷酸，5’端为两个嘌岭，3’端为两个嘧啶。含有CpG 寡核苷酸具有相似的生物学活性。CpG寡核苷酸具有优于传统免疫佐 剂的作用，在抗病毒、抗肿瘤及抗过敏治疗等方面具有广阔的前景， 并必将取代传统的免疫佐剂。本实验以巨噬细胞和树突状细胞为研究 对象，通过对CpGmotif的选择、寡核苷酸骨链的修饰等，力争筛选出 毒副作用小，抗肿瘤效果好的CpG寡核苷酸，为其将来的临床应用打 下基础。 ～、I方法：在体外实验中，制备脾细胞、巨噬细胞及单核细胞来源和 脾来源的树突状细胞。CpG寡核苷酸分别与上述各种细胞共育24小时。 测定细胞培养上清液中IL．12、TNF．a和NO的含量及巨噬细胞、NK 细胞的杀伤活性。在体内抗肿瘤实验中将荷瘤小鼠随机分成6组：TES DNA阳性对照组。治 阴性对照组、CpG寡核苷酸治疗组四组及E．coli 疗7天后处死小鼠，称量肿瘤、测定小鼠血清中IL-12和NO的水平及 NK、巨噬细胞的细胞毒活性。 结果：1．各CpG寡核苷酸(CpG．ODNs)均能促进脾细胞、巨噬 细胞和树突状细胞分泌IL一12和TNF-a。A6、A9促进上述细胞分泌IL一12 的能力最强，而促进它们分泌TNF—a的能力相对较弱。A5、A8则正 相反。具有相同核苷酸序列的PO．G、PS和PO中，PO．G刺激上述细 胞产生细胞因子的能力最强，其次为PS，最弱为PO。 2．各CpG寡核苷酸均能促进巨噬细胞分泌NO。A6、A9促进巨 噬细胞分泌NO的能力最强。具有相同核苷酸序列的PO．G、PS和PO 中，PO．G刺激巨噬细胞产生NO的能力最强，其次为PS，最弱为PO。 3．各CpG寡核苷酸均能促进NK细胞和巨噬细胞的细胞毒活性。 A6、A9的激活能力最强。具有相同核苷酸序列的PO．G、PS和PO中， PO．G激活NK和巨噬细胞的能力最强，其次为PS，最弱为PO。 4．A6的体内抑瘤作用最明显。经A6治疗的小鼠体内IL．12和 NO水平最高，体内NK细胞和巨噬细胞的杀伤活性最好。 结论；CpG寡核苷酸的3’端连接6个鸟苷酸(PO．G)能够增强 CpG寡核苷酸的免疫激活活性，例如PO．G能够促进巨噬细胞、树突 状细胞分泌高水平的IL．12．在寡核苷酸的3’端连接G6能够延长寡 核苷酸的半寿期。其次，G6能够与抗原递逞细胞上的SR受体结合， 从而使CpG寡核苷酸有效的被抗原递逞细胞摄取。CpG．PO．G既能激 发有效的、持久的Thl免疫应答，又不会引发类似PS引起的毒副作用。 在CpG寡核苷酸的3’端连接G6是一种非常有希望的修饰手段，有利 于CpG寡核苷酸应用于治疗。 本实验对A7、A8和A9促进抗原递逞细胞分泌IL．12和TNF．a的 能力进行了比较。A9相对于A7、A8在治疗方面更为理想，因为它能 促进抗原递逞细胞分泌高水平的IL-12而TNF．d分泌量相对较低。同 一情况可见于与上述三CpG寡核昔酸具有相同核苷酸顺序的PO．G中。 如前所述，PO—G的生物活性优于PS，A6一A9的PO．G形式促进抗原 2 递逞细胞分泌细胞因子的能力强于A9。除了细胞因子分泌方面，A6 在促进巨噬细胞分泌NO，增强巨噬细胞和NK细胞细胞毒活性方面也 具有一定的优势。 CpG寡核苷酸是通过激活抗原递逞细胞而引发TM免疫应答的。 巨噬细胞和树突状细胞被认为是CpG寡核苷酸第一作用的对象。树突 状细胞在抗肿瘤过程中起着重要作用。在本实验中，A6具有最强的刺 激树突状细胞分泌IL一12的能力，同时刺激树突状细胞