新型双功能糖苷的表达纯化及功能研究.pdfVIP

新型双功能糖苷酶的表达纯化及功能研究 中文摘要 中文摘要 目的：抗体的糖型对抗体的功能有着极其重要的影响，PNGase F 和Endo F2 是糖苷酶家族中的重要成员，在抗体和抗体糖型的鉴定中发挥着重要作用，但这 两种酶的酶切最适pH 值差异巨大，无法在同一pH 的缓冲液下进行抗体单步酶切， 并且PNGase F 无法切除位于抗体Fab 段的糖链。若抗体在多个部分有糖基化修饰， 那么就要两种酶进行多步酶切，而这会对后期抗体及其糖型的检测造成不可控的 影响，如何在同一pH 下使两种酶均能发挥作用目前尚未有研究。 方法：分别通过全基因合成得到PNGase F 及Endo F2 基因片段，采用大肠杆 菌进行表达，纯化过后得到了PNGase F 及Endo F2 ，然后通过晶体模拟及蛋白参 数的运算，决定采用融合蛋白的方式来完成Endo F2 的pH shift ，确定了通过串联 两段基因进行表达的可行性，将Endo F2 及PNGase F 基因串联片段克隆到pET32a+ 载体上，并诱导大肠杆菌表达获得大量重组可溶性的糖苷酶，进而采用两步纯化， 得到具有活性的高纯度“