丝状真菌基因工程精要.ppt

* 真菌包括霉菌（丝状真菌）、酵母菌和蕈菌三个类群。由于真菌兼具微生物遗传学特征和动植物分子学机制，因此以真菌为受体细胞的基因工程具有重要的研究意义和应用价值。 丝状真菌某些种属的优势特征： 1.表达分泌大量蛋白质 2.长期安全的用于生产酶和抗生素 3.发酵过程成本低廉且可操作性强 1.选择性标记基因 2.整合序列或复制子结构 3.一些表达型质粒还含有性能优良的丝状真菌 表达调控元件 标记 来源 选择系统（基因产物） 营养缺陷型 arg + A.nidulans 精氨酸原养性（鸟氨酸转氨甲酰酶） pyr – I +（pyr –G +） N.crassa 尿嘧啶原养性（乳清酸核苷-5-磷酸脱羧酶） 抗药性 HygB + E.coli 潮霉素B抗性（潮霉素B磷酸转移酶） Neo r E.coli G418抗性（G418磷酸转移酶） Bleo r E.coli 博来霉素抗性（博莱霉素结合蛋白） 功能产物 amdS + A.nidulans 乙酰胺利用（乙酰胺酶） 其他 LacZ + E.coli 颜色选择（孢子）（β-半乳糖苷酶） 1.整合型质粒 2.自主复制性质粒 转化各种丝状真菌均能获得稳定的转化子，绝大多数供体DNA片段均整合在受体菌染色体DNA的同源位点外侧。但转化频率相当低，一般只有10-20转化子/μg DNA。 在在丝状真菌中较不稳定，其转化仅在少数受体系统中获得成功，主要原因是丝状真菌的多核生长状态强烈抑自主复制型质粒在子代细胞中的等量分配。构建自主复制系统的关键是寻找丝状真菌的ARS 序列。ARS序列有利于质粒的自主复制和提高其在宿主菌中的稳定性。 总DNA的提取方法： 1.新鲜菌丝体，液氮冷冻，研碎 2.加入500μlTES缓冲液悬浮 3.余500μlTES饱和的苯酚混合均匀，离心 4.水相用苯酚和氯仿萃取一次 5.萃取液用乙醇沉淀 6.沉淀用250μlTE缓冲液悬浮 7.加入2.5μlRNaseA（10mg/ml），37℃保温1h 8.用苯酚萃取一次，氯仿萃取两次 9.在水相中加入150μl 5 mol/L的NaCl 和400μl的 PEG6000，冰浴1h，离心 分离克隆基因主要的方法： 1.突变遗传互补法 2.随机整合法 3.cDNA差示克隆法 4.染色体走读法 转化方法： 1.CaCl2/PEG诱导的原生质体转化法 2.脂质体介导的原生质体转化法 3.电穿孔法 4.醋酸锂介导的完整细胞转化法 转化效率和方法取决于质粒的性质。 FDA批准的基因工程安全受体菌（GRAS）: 硫曲霉菌和黑曲霉菌 构建绝对安全有效的宿主转化系统包括两方面的工作： 1.切除与毒素生物合成有关的基因，彻底杜绝受体菌基因突变重新合成毒素的可能性； 2.构建位点特异性整合的载体系统，阻止转化质粒由于随机重组整合而对丝状真菌受体菌基因组造成的任何获得性或缺陷性基因突变现象的发生。 5.1.3.1基因的表达调控原件 丝状真菌中DNA顺式元件的排列方式 蛋白质的成熟与分泌与其在细胞内的正确折叠密切相关，二硫键异构酶（PDI）和肽基脯酰胺顺反异构酶（PPIase）对于蛋白质的折叠十分重要。 许多信号肽序列可在丝状真菌中发挥作用，一般不需要将异源基因与丝状真菌信号肽序列融合。但也有例子证明信号肽序列对分泌有影响。 糖基化修饰反应是异源蛋白质加工的一个重要内容。 丝状真菌能产生和分泌几乎所有已知的蛋白酶家族，其中内切肽酶的含量最为丰富。蛋白酶的降级作用是异源蛋白产量较低的主要原因。 利用基因同源交换技术或紫外诱变技术灭活产量较大的蛋白酶基因，可从根本上解决异源蛋白的降解作用。 重组凝乳酶的生产 重组白细胞介素的分泌表达 重组磷脂酶A2的生产 自弗莱明1928年发现青霉素以来，筛选优良生产菌株的工作全面展开。DNA重组技术也运用到生产菌的改良。 改良抗生素生产菌的三种战略 1.解除抗生素生物合成途径中限速步骤对最终产物的影响。 2.构建具有不同生物代谢途径的工程菌。 3.利用已克隆的生物合成基因构建抗生素高产工程菌。