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温州医学院硕士论文 EB茄莓LMP2 T、B细胞重叠表位的预测、筛选和鉴定 中文摘要 目的： Latent 基于本实验室对EB病毒(Epstein．Barrvirus，EBV)潜伏膜蛋白2fEB membrane protein2,LMP2)B细胞表位筛选的结果，对已筛选的3个免疫优势B细 LMP2T、 胞表位及其上下游的氨基端肽段预测其T表位，进一步筛选和鉴定EBV B细胞重叠表位，为其单克隆抗体的制备及EBV相关肿瘤免疫防治研究提供理论 依据。 SYFPEIn缸服务器上的EPITOPEPREDICTION方法，在本实验室已筛选的3个B细 Tcell，CTL)表位。根据筛选肽上的氨基酸是否为锚定残基、辅助 (cytotoxicity 残基或优势残基进行记分，选择分值较高的氨基酸肽段为免疫优势T细胞表位， LMP2 即为EBV CTL表位和B细胞重叠表位，并进一步对筛选的T、B细胞重叠表 位进行鉴定和免疫效应的研究。 方法： 1．EBVLMP2 HLA—A*0201限制性CTL和B细胞重叠表位的预测 从SwissProt蛋白数据库获得EBV LMP2的氨基酸序列，以数据库Syfpeithi、 EBV LMP2免疫优势B细胞表位及其上下游肽段，分别预测EBVLMP2中 CTL表位，选择CTL和IB细胞表位重叠的EBVLMP2中的氨基酸短肽，作为T、B 细胞重叠优势表位为目的表位进行鉴定，并进一步进行免疫效应的研究。 2．表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案进行合成，采用 高效液相色谱法IqPLC纯化及进行质谱法分析鉴定。 3．CTL和B细胞重叠表位肽的鉴定 对上述合成的CTL和B细胞重叠表位肽作进一步鉴定。 (1)重叠表位肽的CTL表位活性鉴定：①利用T2细胞分析预测的重叠肽与 HLA．A*0201分子结合的亲和稳定性：②利用乳酸脱氢酶(LDH)释放法，检测重叠 温州医学院硕士论文 表位肽诱导的体外细胞毒杀伤活性；③通过ELISPOT和细胞内细胞因子染色 (ICS)方法，检测重叠表位肽刺激其特异性CTL细胞分泌的IFN，水平，鉴定EBV LMP2的HLA-A*0 201限制性CTL表位的活性。 (2)重叠表位肽的B细胞表位活性鉴定：利用动物免疫的方法，即采用纯化 的合成肽偶联BSA，在BALB／C雌性小鼠(5只／组)后背部皮下多点免疫注射，以 两周，于免疫第0w，1w，3w，5w，7w，9w周分别收集血清，制备免疫血清抗 体。采用间接ELISA方法检测重叠表位肽在不同免疫时间段的抗体效价，免疫原 性，及其诱导抗体与EBV抗原的结合能力是否受CTL表位存在的影响。 结果： 1．CTL和B细胞重叠表位预测结果及初步筛选 根据Syfpeithi预测，以本实验室对EBVLMP2的B细胞表位鉴定结果为基础， 1N 名为EBplEBpl2。 2．重叠表位肽的合成 由西安华辰生物科技有限公司采用标准固相肽合成Fmoc方案合成，经高效液 相色谱法HPLC纯化，以此获得纯度接近或高于95％的肽产物，经质谱法MS鉴定 氨基酸的序列，同时测定分子量，所得测定值与理论值相符。成功获得了高纯度 的合成肽EBpl 1、EBpl2、EBpl3矛IEBpl4，为进一步表位鉴定奠定了基础 3．重叠表位肽的进一步鉴定 本实验筛选的EBpl3和EBpl4与T2细胞的结合的亲和力以及稳定性与与阴性对 照肽有显著性差异(Po．05)，但与阳性对照肽均无显著差异(Po．05)。 为效应细胞，以T2细胞为靶细胞，结果当效靶比(E：T)为40：l及20：l时． 3 垫型垦兰堕堡主坠奎