igf-1体外导人脐带间充质干细胞向神经样细胞分化.pdfVIP

中文摘要 IGF．1体外诱导人脐带间充质千细胞向神经样细胞分化 摘 要 umbilicalcord 目的：对人脐带间充质干细胞(human stem (insulin．1ike growth 胞分化的作用和条件，为hUMSCs神经分化以及临床应用提供理论和实 验基础。 方法：取足月妊娠剖宫产健康胎儿的脐带，以D．Hank’S充分冲洗， 剔除脐动脉和脐静脉，将剩余的脐带间质组织切割成lmm3大小的组织块， O．2％胶原酶II消化，在含有20％胎牛血清(FBS)、2ng／ml表皮细胞生长 因子(EGF)、25 ug／ml 链霉素的DMEM／F12中培养。观察原代培养细胞的形态学变化，当细胞 达80％～90％汇合时，加入0．25％胰酶．1mMEDTA消化细胞，并传代。 收集消化后的细胞，采用流式细胞术行细胞表型检测，包括CD73、 CD90和CDl05、CDl9、CD34、CD45、CDl1和组织相容性抗原HLA．DR (MHC．II)，以抗鼠IgGl．PE和IgGl．FITC作为同型对照。 态变化，细胞达到90％以上融合时按1：2或1：3比例进行传代，绘制细胞 生长曲线。 被的六孔板中(每个六孔板为一组)，待细胞融合达到70．80％时，三个六 IGF-l的无血清低糖 孔板分别换为含有25ng／ml、50ng／ml、100ng／ml DMEM／F12培养基的诱导液，为实验组；另一六孔板为对照组，除不加 IGF．1外其余均同实验组。镜下观察细胞形态变化，每2小时在高倍显微 典型神经样细胞形态(有明显的两个及以上突起形成，细胞体屈光性强， 类似神经元样细胞)的细胞数及总细胞数，用以计算分化率，结果以均数 中文摘要 率高且稳定的一组诱导后8h用免疫细胞化学技术检测星形胶质细胞标志 数阳性细胞，计算阳性细胞率结果以均数±标准差表示。 结果：原代细胞传代24h后，大部分细胞逐渐贴壁，细胞呈菱形、三 角形、椭圆形等形态；随着培养时间的延长，渐变为长梭形，细胞数量逐 仍保持旺盛的生长能力。流式细胞检测P3、P5和P10代细胞的分子标志 CDl9、CDllb和HLA—DR。 加入IGF诱导液后30 胞开始发生形态改变，25ng／ml组细胞开形态改变不明显。光学显微镜下 可见：胞体收缩变圆，伸出指状突起，细胞体折光度增强；随着诱导时间 的延长，细胞进一步收缩，突起较前增长，1h后个别细胞形成双极突起， 以100ng／ml组变化细胞数量最多同时也可以看到该组内有少量细胞死亡 漂浮于培养基上。4h后50ng／ml和100ng／ml组细胞折光度增大，突起较 前更加细长、增多，多在2至5条，有的细胞逐渐形成多级突起，25ng／ml 成树突样网络，25ng／ml组细胞形态改变较前不明显；随诱导时间延长， 分化的细胞形态越来越典型，但死亡、漂浮的细胞也逐渐增多，以100ng／ml 组死亡的细胞最多；24h后100ng／ml组细胞大量死亡，仅有少量细胞存活 且细胞透亮度降低；50ng／ml组存活细胞表现出更为典型的神经细胞样改 变，这些细胞的胞体折光度增大，细胞质向细胞核收缩，形成双极、多极 样突起；有的呈放射状伸展，突起伸长更加明显，可以看到2、3级突起， 但同时死亡细胞也逐渐增多，漂浮于培养基表面。免疫组化染色可见大量 胞着色较深，Nestin阳性细胞着色较浅；免疫荧光染色也显示其GFAP、 NSE，Nestin呈阳性表达；对照组免疫组化和免疫荧光染色只有极少量的 细胞表达GFAP，而不表达NSE和Nestin。 结论：hUCMSCs由脐带中分离纯化后可以在体外稳定传代，并保持 中文摘要 lb和组织 关键词：人脐带间充质干细胞；胰岛素样生长因子．1；分化；神经样 细胞；