血清抗hter自身抗体作为癌症诊断标志物的初步研究.pdfVIP

目 录 摘 要1 前 言3 材料与方法5 结 果27 讨 论42 参考文献48 英文摘要50 致 谢52 略缩词表53 论文独创性声明55 附：综述56 贵阳医学院2012 届硕士研究生论文 血清抗hTERT 自身抗体作为癌症诊断标志物的初步研究 专业：临床检验诊断学 研究生：周爱群 导师：刘杰麟 教授 摘要：目的：通过构建人端粒酶逆转录酶中段 （hTERT-m ）、C-端 （hTERT-c ） 蛋白原核表达系统，并分离提纯获得高纯度的hTERT-m 和hTERT-c 蛋白，以此 两种蛋白为抗原利用间接ELISA 技术检测癌症患者血清抗hTERT 自身抗体水 平，为血清抗hTERT 自身抗体能否作为一项新的肿瘤标志物提供实验依据。 方法： 1. 质粒载体 pMAL-c5X 和重组质粒 pMAL-p5X-hTERT-m 、 pMAL-p5X-hTERT-c 经限制性内切酶BamH Ⅰ和 Nde Ⅰ双酶切，琼脂糖凝胶电 泳分离后，割胶回收获得带有相同粘性末端的质粒载体和目的基因，T4 DNA 连接酶16℃连接过夜；2. 连接产物转化克隆菌株NEB10- β大肠杆菌感受态细 胞，提取重组质粒进行酶切及测序验证；3. 重组质粒 pMAL-c5X-hTERT-m 、 pMAL-c5X-hTERT-c 转化表达菌株TB1 大肠杆菌感受态细胞，挑取单个菌落进 行小培养，0.3 mmol/L IPTG 诱导目的蛋白表达，经 12%SDS初步验证目 的蛋白是否表达；4. 重组表达菌TB1 扩大培养，0.3 mmol/L IPTG 诱导目的蛋 白表达，运用直链淀粉树脂层析柱和BioLogic DuoFlow 蛋白纯化仪分离提纯目 的蛋白，经SDS、Western blot 鉴定、考马斯亮蓝染料结合法测定蛋白质 浓度。5. 利用间接ELISA 法检测 135 例癌症患者、96 例良性疾病患者及 135 例正常对照组血清抗hTERT-m 和抗hTERT-c 自身抗体的水平，检测结果进行统 计分析。 结果：①成功构建pMAL-c5X-hTERT-m-TB1 、pMAL-c5X-hTERT-c-TB1 原核表 达系统，并能大量表达可溶性目的蛋白；②成功获得高纯度重组 hTERT-m 和 hTERT-c 蛋白，浓度分别为0.266 mg/mL 和1.0 mg/mL ；③间接ELISA 法检测 血清抗hTERT-m 和抗hTERT-c 自身抗体结果发现：正常对照组、良性疾病组和 癌症组血清抗 hTERT-m 自身抗体测定 OD 值（ ±s ）分别为0.302±0.063 、 X 0.421±0.093 和0.525±0.166 ，抗hTERT-c 自身抗体测定OD 值 （ ±s ）分别为 X 0.400±0.075 、0.527±0.107 和 0.650±0. 187；癌症组高于良性疾病组和健康对照 组（P 0.001 ），良性疾病组高于正常对照组 P 0.001 ；肺癌、大肠癌、乳腺癌 和卵巢癌患者血清抗hTERT 自身抗体水平高于相应良性疾病患者血清，差异有 1 贵阳医学院2012 届硕士研究生论文 统计学意义。 结论：癌症组患者血清抗hTERT-m 和抗hTERT-c 自身抗体水平显著高于良性疾 病组患者和正常对照组，提示血清抗hTERT-m 和抗hTERT-c 自身抗体有可能成 为一项新的肿瘤标志物。 关键词：人端粒酶逆转录酶；原核表达系统；间接ELISA；癌症；亲和层析 2 贵阳医学院2012 届硕士研究生论文 前 言 肿瘤 tumor，neoplasm 是一类常见病、多发病，其中癌症是目前危害人类 [1] 健康最严重的一类疾病。据最新癌症统计数据显示 ，2008 年全球新发癌症病 例数 1270 万，死亡病例数760 万，相比2002 年的统计数据均显著上升；而其 中56%的新发病例和64%的死亡病例发生在发展中国家。随着手术、化疗、放 疗等治疗方法的进步，许多癌症患者的长期存活率有所提高，但部分患者仍不 能免于复发或转移，尤其是大部分癌症患者在发现时已属晚期，更为其治疗增 加了困难。 端粒及端粒酶的发现为肿瘤的研究翻开了新篇章。研究发现，端粒酶的激 活与肿瘤的形成密切相关。人类端粒酶（human telomerase ），是一种包含多个 亚基的特殊逆转录酶，能够维持真核生物染色体末端即端粒（telomere ）的稳定 性及长度。端粒酶的催化中心主要由其蛋白组分端粒酶逆转录酶 human telomerase reverse transcriptase ，hTERT 和 RNA 组分端粒酶 RNA h