蛋白质印迹-20101129.ppt

Western blot 实验技术 概 论 印迹法是指将样品转移到固相载体上，而后利用相应的探测反 应来检测样品的一种方法。 1975年，Southern建立了将DNA转移到硝酸纤维素膜（NC膜）上，并利用DNA－RNA杂交检测特定的DNA片段的方法，称为 Southern印迹法(southern blot)。 而后人们用类似的方法，对RNA和蛋白质进行印迹分析。 Northern blot: 对RNA的印迹分析 Western blot:对单向电泳后的蛋白质分子的印迹分析 Eastern blot: 对双向电泳后蛋白质分子的印迹分析 Western blot ： 把电泳分离的蛋白质转移到固定膜上，并用抗原抗体反应进行特异性检测的过程。 是集电泳、转印和免疫标记为一体的蛋白质分离检测技术,结合了凝胶电泳的高分辨率和固相免疫测定的特异敏感等特点，可检测到低至1～5ng（最低可到10－100pg）的靶蛋白。 Western blot是检测蛋白质混合溶液中目的蛋白的定性方法，也可作为确定目的蛋白在不同细胞或同种细胞在不同条件下的相对含量的半定量方法 Western blot测定的不是蛋白的绝对含量，只是目的蛋白的相对含量： 目的蛋白的存在与否 特定实验条件下目的蛋白表达量的变化 多种因素影响信号的强弱受，一般仅作为半定量指标 不同目的蛋白由于所用检测的抗体不同，其含量不具有可比性 Western Blot一般流程 蛋白样品的制备 SDS电泳 转膜 鉴定膜上特定蛋白 一 、蛋白质的样品制备 1.蛋白样品提取： 总体原则? 1）提取时尽可能只集中于提取目的蛋白。 通过采用不同提取方法或选择不同的试剂盒产品 2）保持蛋白的处于溶解状态 通过裂解液的PH 盐浓度 表面活性剂、还原剂等的选择 3）提取过程防止蛋白降解、聚集、沉淀、修饰等， 低温操作，加入合适的蛋白酶和磷酸酶抑制剂 4）尽量去除核酸，多糖，脂类等干扰分子 通过加入核酸酶或采取不同提取策略 5）样品分装，长期于-80℃中保存，避免反复冻融。 2.蛋白质浓度测定 通过稀释使不同样品具有相同浓度，必要时需要 对蛋白进行浓缩。常用的蛋白浓度测定方法包括： Bradford法， Lowry法， BCA法 二.SDS电泳 SDS电泳，是在PAGE系统中引进SDS（十二烷基硫酸钠），SDS能断裂分子内和分子间氢键，破坏蛋白质的空间结构，而电泳系统中存在的强还原剂（DTT或β-巯基乙醇）能使半胱氨酸之间的二硫键断裂，蛋白质在一定浓度的的SDS溶液中，与SDS分子按比例结合，形成带负电荷的棒状结构的SDS-蛋白质复合物，降低或消除了不同蛋白质分子间天然的电荷和分子形状的差异，蛋白质在电泳时的迁移速度仅取决于其分子大小。 当分子量在15～200 KD之间时，蛋白质的迁移率和分 子量的对数呈线性关系，符合下式： logMW=K-bX 式中： MW: 分子量 X: 迁移率 k、b: 常数 凝胶成份 丙烯酰胺(Arc)和N,N’-亚甲双丙烯酰胺(Bis) ?? SDS 配胶的Tris缓冲液 TEMED AP (时间) Tris-甘氨酸电泳缓冲液 PAGE胶的孔径随?“Bis～Arc”?比率的增加而变小， 比率接近?1：20?时孔径达到最小值。 SDS聚丙烯酰胺凝胶大多按“Bis～Arc”?为1：29?配制，研究表明它能分离分子量大小相差只有3%?的蛋白质。 凝胶浓度与蛋白分离范围 优点： 1.包装方便携带和使用 常温储存在48孔板中，使用不需解冻，只需用枪头刺穿外层薄片，将枪头中的10ul去离子水注入Marker干粉中吸起来就可使用 2. 独立包装可以防止污染 3. 分子量范围较广，从18.5kD到215kD（4-20%SDS） 4. 凝胶上和转移膜上各条带分布水平和显色水平一致 5. 可用于染色（考马斯亮蓝染色和银染）。 分离胶不要灌得太满。 gel通常在0.5-1h内凝集最好。 混合搅拌速度要适当，太快产生气泡影响聚合，导致电泳带畸形；太慢不均匀。 影响电泳效果的因素： 1.电压 低电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。电压越小，条带越漂亮。 2.胶的均匀度 胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。 电泳结果检查： 考马斯亮蓝染色：使用简便快速，可以分辨1ug左右的条带，是最经济通用的蛋白PAGE胶电泳染色方法。 银染：操作复杂一些但分辨率高很多，可以分辨2-5ng蛋白。 以上两种染色方法染料与蛋白不可逆结合，干扰后面的 Western Blot实验，可选择同样的样品跑2块胶，一块 染色一块转膜 半