5分子生物学研究方法()资料.pptVIP

第五章 分子生物学研究方法 5.1 重组DNA技术发展史 5.2 DNA操作技术 5.3 基因克隆技术 5.4基因表达研究技术 5.5蛋白质组学及研究技术 目的基因的来源 原核细胞 真核细胞：cDNA或gDNA文库 人工合成及PCR扩增目的基因 噬菌体载体：双链DNA病毒，约50kb,两端有一个12个核苷酸5′端突出粘性末端 克隆载体所容纳的外源DNA片段的大小 质粒：10kb λ噬菌体：23kb 黏粒：45kb BAC：350kb YAC：1000kb 5.2.1 细菌转化 常用的转化方法： 化学转化（CaCl2）法 电击法 化学转化原理： 在0℃冷冻处理时，处于CaCl 2低渗溶液中的大肠杆 菌细胞膨胀成球形。DNA可吸附于其表面。在短暂的 热冲击下，细胞吸收外源DNA ，然后在丰富培养基内 复原并增殖，表达外源基因。 电击转化： 使用低盐缓冲液或水洗制备的感受态细胞，通过 高压脉冲的作用将载体DNA分子导入受体细胞。 克隆的筛选： 抗生素基因。 常用的抗生素有：氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素、四环素、链霉素等 ?-互补蓝白斑筛选 营养条件（自养、异养） ?-互补筛选 β-半乳糖苷酶基因（LacZ）的调控序列和氨基端（N端）146个氨基酸编码序列的质粒 编码β-半乳糖苷酶羧基端（C端）部分序列的宿主细胞 IPTG/X-gal的培