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中国不同疫区L．dITS序列分析及 三．P．PAL、HSP60基因克隆和真核表达 病原生物学专业 研究生田玉 指导教师 陈建平教授 利什曼病是WHO／TDR列出的对人类危害严重的六类热带病之一。利 什曼原虫属包含很多不同的种和亚种，其分类相当复杂。在世界范围内， 利什曼原虫不同的种及弧种可引起不同类型的利什曼病，它们具有不同的 流行病学特征。利什曼原虫种株的分析和鉴定对于提高临床疗效、控制此 病的流行有重要意义。在我国，主要流行的是由杜氏利什曼原虫(Leishmania donovani，L．d)导致的内脏利什曼病，即黑热病。该病对人体危害严重， 是威胁患者生命的人兽共患病。我国的内脏利什曼病流行区根据地理分布 和传染源不同分为荒漠型(野生动物源型)、山丘型(犬源型)和平原型(人 源型)，不同疫区的内脏利什曼病在患者发病年龄、治疗效果、是否易复发 和有无保虫宿主等方面有着明显的差异，但病原体形态难以区别。传统的 种株分析方法主要依据地理位置、临床表现、流行病学特征、原虫形态等 外在特征进行分类，这对确定我国不同疫区利什曼原虫种株之间的关系往 往不够。在现代分类研究中，分子生物学技术的运用越来越多。多年以来， 为从分子水平揭示我国不同疫区利什曼原虫种株间的差异，从而为黑热病 的防治提供科学依据，在该领域进行了许多极有意义的研究，如对利什曼 原虫kDNA、nDNA的研究，用l【DNAPCR-SSCP、RAPD分析等多种方法 对我国不同疫区利什曼原虫分离株进行它们之间同源性的分析及种株鉴 定。但由于其复杂性，出现了一些不一致的结论。因此我们有必要进一步 深入研究，从基因水平上进一步揭示我国不同疫区杜氏利什曼原虫分离株 之间的关系，从而在根本上为我国黑热病的防治提供科学依据。 核糖体存在于所有的原核生物和真核生物细胞内，主要功能是作为细 胞中蛋白质合成场所。利什曼原虫编码核糖体的基因rDNA基因位于单一 的染色体上，头尾相接，呈串珠状，拷贝数为160个重复单位。每个熏复 而重复单位之间为非转录的基因间隔区(NTS)，长度平均为8．5kb。rDNA 基因内转录基因间隔区(ITS)平均长度为lkb。由于rDNA基因的高度保守性 使其突变累积在成串重复排列的rRNA基因之间和两侧的间隔区序列中，而 使核糖体基因间隔区序列具有种内和种间、以及亚种和株的特异性，从而 应用于分类学和种株鉴定，ITS的序列分析在植物、动物、真菌、原虫等系 统进化和分类学研究中已被广泛应用。 本研究用PCR方法扩增我国荒漠、山丘及平原疫区杜氏利什曼原虫分 离株L．dXJ771，L．dSCl0及厶d$192的ITS片段(包含5．8SRNA基因及 其两侧的ITSl和ITS2片段)，分别将其克隆入pMDl8一Tvector，进行序列 测定及分析。首次报道了我国荒漠、山丘和平原疫区杜氏利什曼原虫分离 株的ITS序列及三者之间的差异。研究结果显示：5．8SRNA基因不论是这 三个疫区分离株之间，还是与Gene bank内其他利什曼原虫分离株之间， 其核苷酸序列一致性均达到99％以上，充分显示了rRNA基因的保守性。而 ITSl及ITS2片段则在各分离株之间存在较大的差异性，也充分显示了我国 三个疫区分离株之间及与国外利什曼原虫分离株之间同源程度的差异。其 中三．dSCIO与Ld．SD2均缺失L．d 78个核苷酸序列，系国内外首次报道。 根据我国3个疫区利什曼原虫分离株的ITS序列的差异，可推导出荒 漠分离株、山丘分离株与平原分离株之间存在同源性的差异，各自都有其 较独特的ITS核苷酸序列区域。且3个疫区利什曼原虫分离株的ITS序列 在同源程度上也存在明显差异。荒漠分离株与平原分离株及山丘分离株距 离较远，与之相比较，平原分离株与山丘分离株之间的距离相对略近一些， 荒漠分离株与山丘分离株的同源性略高于荒漠分离株与平原分离株的同源 2 性。 通过对ITS片段序列的分析，从基因水平进一步说明了我国荒漠疫区、 山丘疫区、平原疫区利什曼原虫分离株之间存在的差异。这从一定程度上 解释了三个疫区黑热病在临床症状、药物治疗、流行病学等方面存在的不 同，进一步揭示不同分离株之间的关系