中国人群特异的聋相关基因slc26a4基因新变异致病性鉴定及其致聋机制研究.pdfVIP

中文摘要 中国人群特异的耳聋相关基因SLC26A4基因新变异致病性鉴定 及其致聋机制研究 摘 要 目的： vestibular 大前庭水管综合征(1arge aqueduct vestibular enlarged aqueduct 有感音神经性聋(SNHL)为特征的一种常染色体隐性遗传性非综合征型听 力障碍性疾病。目前研究表明，大前庭水管与SLC26A4基因突变有关，是 综合征和单纯前庭水管扩大和或内耳畸形有密切的关系。据估计，世界范 合征的报道还较少，但前庭水管扩大在耳聋患者中占有相当的比例。 子进行转运，在机体离子成分平衡的维持中发挥重要作用。因该基因较大 胎脑中也有分布。在内耳，Pendrin表达于内淋巴管、内淋巴囊、椭圆囊、 球囊等处。Everett等发现在胚胎13天，小鼠内淋巴管和内淋巴囊就有 SLC26A4基因mRNA的强表达，淋巴管和内淋巴囊与内淋巴液代谢有关， 将限制保护性谷胱甘肽的产生从而增加自由基压力，HC03(一)的移除有助 于保护血管纹免受自由基损伤，维持其正常功能。关于SLC26A4基因突变 引起疾病表型的具体机制目前还没完全明了。2008年发表于-mG的一项 韩国研究认为不同突变通过不同机制导致Pendrin蛋白构象和离子转运 功能障碍，该研究发现大多数突变的异常蛋白产物滞留在细胞内，而野生 中文摘要 型蛋白表达在胞浆膜，从而影响了C1(一)／HC03(一)离子交换功能。此外， 突变蛋白也表现出明显的异质性，例如H723R突变蛋白产物主要存在于细 胞的内质网，低温孵育下这种蛋白产物的异常修饰及受损害的离子转运功 能能很大程度的恢复，L236P突变蛋白产物则主要停留在细胞的中心体 区，对同样的温度治疗不敏感。聋病分子流行病学调查显示该基因变异在 中国耳聋人群中具有广泛的异质性，其中部分突变在其他人种未见报道。 那么，新变异是否能引起确切的疾病表型亟待功能研究证实。本研究拟建 立一套SLC26A4基因新变异致病性鉴定系统以分析新发现变异及其致病 基因型表型相关性，指导临床SLC26A4相关耳聋的基因诊断及产前诊断。 方法： Pendrin融合蛋白 设计引物扩增SLC26A4基因eDNA序列，将其与pCRII-TA质粒连接。 白 pEGFP-N1质粒上，使其能表达变异的Pendrin融合蛋白 异分别设计包含碱基变异位点的一对引物(正、反)，应用发展成熟的 Site—directed QuikChange Mutagenesis试剂盒进行定点诱变。与模板 质粒退火后用PfuTurbo聚合酶“循环延伸’’，正反向引物的延伸产物退 火后配对成为带缺刻的开环质粒。Dpn I酶切延伸产物，由于原来的模 板质粒来源于常规的大肠杆菌，是经dam甲基化修饰的，DpnI敏感而 被切碎，而体外合成的带突变序列的质粒由于没有甲基化而不被切开， 因此在随后的转化中得以成功转化，即可得到突变质粒的克隆，并突变 质粒进行测序筛选验证。 ． 异后异常Pendrin融合蛋白 HeLa细胞 中文摘要 光蛋白(GFP)的荧光信号来鉴定转染效率。 异型SLC26A4后，可以利用免疫荧光技术通过激光共聚焦显微镜观察野生 力。 4．用同位素标记法测量细胞内的甲酸根离子。 结果： 布的NM ．1比较序列完全一致。 后，WesternBlot检测出87kDa大小的蛋白。 3．通过将各种质粒转染细胞后发现，野生型SLC26A4基因表达产物 达于细胞膜上，有的表达于细胞质内，有的在细胞膜和细胞质内均有表达。 4．通过同位素标记法测量出各种转染后细胞内的甲酸根离子，实验显 示突变基因表达的Pendrin蛋白对于甲酸根离子的转运效率发生了不同程 度的下降。 结论： 生改变，有的表达于细胞膜上，有的表达于