伤寒沙门菌suc基因及t4606基因的生物学功能分析.pdfVIP

伤寒沙门菌 sufC 基因及 t4606 基因的生物学功能分析 中文摘要 伤寒沙门菌sufC 基因及t4606 基因的生物学功能分析 中文摘要 目的: 课题组前期研究发现伤寒沙门菌sufC及t4606基因的表达受两个重要的调节因子 RpoE和RpoS 的双重调控，推测其可能在伤寒沙门菌致病过程中发挥重要作用。sufC 在其他肠道致病菌中对铁离子的转运至关重要，参与细菌对抗宿主细胞的氧化应激； 伤寒沙门菌t4606 基因编码一未知功能的蛋白质，对其基因序列分析发现具有 Patatin-like phospholipase 的功能基序，本研究旨在对sufC 基因及t4606 基因在伤寒沙 门菌中的功能进行鉴定，揭示两者在伤寒沙门菌致病过程中的作用。 方法: 一、伤寒沙门菌sufC功能研究 ( 1 ) sufC基因缺陷变异株的制备：用特异性引物扩增带有sufC 基因上下游同源臂 的卡那霉素抗性基因片段,将其电转至含pKD46 的伤寒沙门菌野生株，利用λ-Red系统 制备sufC 的基因缺陷株。 ( 2 ) sufC 基因缺陷回补株的制备：构建重组质粒pACYC184-sufC ，将其及 pACYC184空质粒导入sufC基因缺陷株，制备sufC基因的缺陷回补株及空质粒回补对 照株。 ( 3 ) 生长曲线的测定：分别测定S. Typhi野生株、sufC基因缺陷株、sufC基因缺 陷回补株和空质粒回补对照株在正常条件、高渗应激、酸和氧应激条件下的生长曲线， 比较各菌株的生长差异。 ( 4 ) sufC基因缺陷株的上皮细胞侵袭实验：将伤寒沙门菌野生株、sufC基因缺陷 变异株及其回补株和空质粒回补对照株培养至对数生长期（OD600 0.4 ），分别感染 HeLa细胞（MOI均为10），分析各菌株对上皮细胞侵袭力的差异。 ( 5 ) sufC基因缺陷株在巨噬细胞内的生存实验：将伤寒沙门菌野生株、sufC基因 缺陷变异株及其回补株和空质粒回补对照株培养至对数生长期（OD600 0.4 ），分别感 I 中文摘要 伤寒沙门菌 sufC 基因及 t4606 基因的生物学功能分析 染THP-1 巨噬细胞（MOI均为10），比较各菌株在巨噬细胞内的生存能力差异，同时 在细菌感染巨噬细胞的不同时间点测定上清液中巨噬细胞相关细胞因子的表达水平。 二、伤寒沙门菌t4606基因功能研究 ( 1 ) t4606 基因缺陷变异株的制备：构建t4606 基因缺损型同源核苷酸片段，采 用自杀质粒pGMB151介导的同源重组方法制备伤寒沙门菌t4606缺陷变异株。 ( 2 ) t4606 基因缺陷回补株的制备：构建重组质粒pBAD-t4606，将其及空质粒 pBAD分别导入t4606基因缺陷变异株，制备sufC基因缺陷回补株和空质粒回补对照 株。 ( 3 ) 生长曲线测定：测定S. Typhi野生株、t4606基因缺陷株、t4606基因缺陷回补 株、空质粒回补对照株在普通条件、高渗应激、酸应激和氧应激条件下的生长曲线， 比较各菌株的生长差异。 ( 4 ) t4606基因缺陷株的上皮细胞侵袭实验,方法同上述伤寒沙门菌t4606基因缺 陷株的上皮细胞侵袭实验。 ( 5 ) t4606基因缺陷株在巨噬细胞内生存实验，方法同上述伤寒沙门菌t4606基因 缺陷株的胞内生存实验。 结果： ( 1 ) 经PCR及序列分析验证，成功制备了伤寒沙门菌sufC 、t4606基因缺陷株及 其回补株和空质粒回补对照株。 ( 2 ) 生长曲线表明，sufC缺陷株在普通条件和高渗应激条件下与野生株的生存能 力无明显差异，而在氧应激条件下，sufC缺陷株的生长明显迟缓于野生株，回补sufC 基因至sufC 缺陷株后，回补株的生长恢复至野生株水平。 ( 3 ) 与野生株相比，sufC缺陷株对上皮细胞的侵袭力明显减弱。 ( 4 ) 与野生株相比，sufC缺陷株在巨噬细胞内的生存能力明