人结肠癌细胞株asc基因甲基化状态与凋亡相关性的研究.pdf

人结肠癌细胞株中ASC基因甲基化状态 与凋亡相关性的研究 硕士研究生：王然 指导教师：左云飞教授 专业名称：临床检验诊断学 摘 要 associated speck--like 目的：ASC(apoptosis proteincontaining CARD)是一种抑癌基因，又称为与甲基化相关的基因沉默的下游靶向 pyrindomain，PYD)和caspase聚集区(acaspase 物，可编码pyrin区(a recruitmentdomain，CARD)，而这二种蛋白区在调节凋亡和免疫反应中 均起到重要作用，许多含PYD和CARD的蛋白突变与自身免疫性疾病、 癌症的发生有关。然而，在人结肠癌细胞株中ASC基因甲基化状态与凋 174T、LoVo 亡的相关性还尚未阐明清楚。本实验探讨人结肠癌细胞株LS 和SW480中ASC基因的甲基化状态与凋亡的相关性。拟证明ASC的甲 基化引起基因沉默，同时改变了细胞的凋亡作用，即ASC基因对肿瘤细 胞的凋亡作用。 l 方法：1．为了研究人结肠癌细胞株LS 基因的甲基化状态，本实验首先采用甲基化特异性PCR(MSP)检测结 DNA 肠癌细胞株中ASC的表达情况，应用蛋白酶K／苯酚法和CpGenome Modification Kit试剂盒，提取、纯化和修饰DNA。2．为了研究结肠癌细 胞株中ASC的表达情况，再采用RT-PCR和Western blotting检测细胞株 中ASC的表达情况。3．为了使ASC基因完全甲基化的结肠癌细胞株ASC 基因恢复表达，本实验使用去甲基化药物5一氮一2一脱氧胞苷 LSl 74T细胞中ASC的表达情况。5．应用流式细胞术分析ASC对细胞 凋亡的影响。主要检测药物作用前后细胞凋亡的变化情况。6．应用实时 P53基因的变化情况。 1 结果：1．MSP证明LS74T细胞ASC基因完全甲基化，LoVo细胞 blotting均 证明LSl 74T细胞ASC基因完全甲基化，即基因沉默；而LoVo细胞和 SW480细胞部分甲基化，表达ASC。3．去甲基化药物5一氮．2一脱氧胞苷作 1 用LS l ASC基因恢复表达。4．流式细胞术检测LS74T细胞的凋亡情况，提示 药物作用后细胞凋亡发生改变，药物作用的细胞凋亡率高于对照组。同 时在免疫荧光显微镜下观察到药物作用后细胞凋亡发生改变，药物作用 的细胞凋亡数高于对照组。5．应用实时荧光定量PCR检测六种凋亡基 因，结果表明药物作用后凋亡基因含量改变不具有统计学意义，进一步 证明ASC未通过改变上述六种基因含量而引起肿瘤细胞的凋亡。 甲基化，LSl 74T细胞株ASC基因完全甲基化。在加入去甲基化药物5． 1 细胞的凋亡率明显高于对照组LS74T细胞。因此我们可以进一步证明 ASC是一种抑癌基因，促进细胞凋亡，具有抑制肿瘤的作用。 关键词：ASC基因人结肠癌细胞株 甲基化 表观遗传修饰 2