锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶.pdfVIP

2012 年 第 57 卷 第 9 期：711 ~ 719 《中国科学》杂志社 论 文 SCIENCE CHINA PRESS 锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶 ① ① ① ② ① ① ① ① ③ ② 唐冬生 , 蒋泓 , 刘芳 , 王克振 , 张勇 , 曾芳 , 梁沂梅 , 邓廷贤 , 欧阳宏佳 , 李月琴 , 张细权③, 周天鸿② ① 佛山大学医学院, 佛山 528000; ② 暨南大学生命科学学院, 广州 510632; ③ 华南农业大学动物科学学院, 广州510642 E-mail: tangdsh@163.com 2011-09-03 收稿, 2011-11-15 接受 国家科技重大专项(2009ZX08010-023B)、粤港关键领域重点项目(2008A024200006)、国家自然科学基金和广东省科技攻关计划 (2006资助 摘要 该研究旨在建立锌指核酸酶介导的多位点基因打靶技术, 为获得稳定遗传的转基因动物 关键词 或基因治疗临床应用解决技术难题. 首先利用 OPEN 平台设计、构建能识别人基因组内 rDNA 锌指核酸酶 基因间隔序列的锌指蛋白基因序列, 与 Fok Ⅰ的切割结构域连接、表达后获得锌指核酸酶基因, 基因打靶 再构建锌指核酸酶真核表达载体. 另外, 构建含有 2 条同源重组引导序列和绿色荧光蛋白基因 多位点 (EGFP) 的多位点基因打靶载体. 将锌指核酸酶真核表达载体和多位点基因打靶载体共转染 同源重组 HEK293 细胞, 内参对照PCR-灰度分析法检测外源基因定点整合效率, 结果显示单独转染多位 定点整合 稳定表达 点基因打靶载体的定点整合效率为6.8%; 而由于锌指核酸酶在染色质DNA 上切割rDNA 基因 转基因动物 的间隔序列, 诱导高效同源重组, 锌指核酸酶载体、多位点基因打靶载体共转染的定点整合效率 基因治疗 为24.2%, 较常规基因打靶定点整合率(10−6~10−5)提高了24000 多倍. 共转染的HEK293 细胞在 无任何筛选的条件下持续培养2 个月, 经过20 次传代之后, 子代细胞能够持续表达EGFP, 提示 表达稳定. 本研究建立了锌指核酸酶介导的高效多位点基因打靶技术, 不仅大大提高了外源基 因的定点整合效率, 而且兼顾了基因表达的稳定性和安全性, 为动物定点转基因和人类基因治 疗提供了重要的技术平台, 具有广泛的应用前景. 转基因动物目前还不能像转基因作物那样获得 获得的转基因克隆牛. 但是基因打靶的基因敲入技 商业化的转基因品种, 人体基因治疗还不能批准临 术利用的同源重组靶位点通常为单拷贝序列, 与基 −5 床应用, 关键问题是(1) 很难获得稳定遗传和稳定表 因打靶载体发生同源重组的概率极低, 通常为 10 ~ 达的转基因动物或细胞, (2) 表达效率太低, (3) 安全 10−6 ; 而且常受到位置效应的影响