第一章蛋白质的分离与纯化课件资料.pptVIP

用途 蛋白质纯化 蛋白质纯化后脱盐 蛋白质分子量测定 研究蛋白质寡聚体 A和B物质在层析柱中 1. 分配10次；2. 分配20次；3.分配30次 二者之间总是存在着一定的偏差，这是因为： 层析柱中总是或多或少地存在着纵向扩散 层析过程不可能在绝对分配平衡的情况下进行 理论曲线和实际洗脱曲线是否相符？ 因此，通常实际的洗脱曲线都比理论曲线低而宽 Martin和Synge计算了硅胶柱的理论塔板数， 求得一个理论塔板的高度为0.002厘米 Verzele计算为0.02厘米 1厘米的层析柱最少有50个理论塔板，那么， 在一根20厘米的层析柱上最少可以进行1000 次分配。 一根分配层析柱上到底能进行多少次分配？ 塔板理论的要点： 分配层析柱象分馏柱一样可以分成很多层，每层为 一理论塔板，其高度为理论塔板高度。在一定的 条件下，一根分配层析柱的理论塔板数是一定的 在分配层析柱中，物质只有横向扩散，没有纵向扩 散，而且在两相间达到分配平衡的速度很快 体系中其他物质的存在不影响待分离物质的分配。 待分离物质的存在也不影响其他物质的分配 在分配层析柱上，物质在各个理论塔板中的含量可 通过计算求得 三、塔板理论 第三节 蛋白质的层析分离 层析柱 泵系统（缓冲液） 检测器（记录仪） 部分收集器 液相层析的基本装置 一、离子交换层析 (ion exchange chromatography) 原理： 利用生物大分子与具有相反电荷的离子交换剂之间相互作用不同而进行的分离 类型： 阴离子交换剂 (anion-exchange chromatography) 阳离子交换剂 (cation-exchange chromatography) 样品的准备 剂型的选择 离子交换剂的预处理 装柱(样品体积的2-5倍） 柱效应的标定 上样 洗脱 操作要点： 分步洗脱法 (stepwise elution) 梯度洗脱法 (gradient elution) 目的蛋白的鉴定与回收 离子交换剂的再生与储存 离子交换层析 原理： 利用分子筛效应分离提纯具有生物活性的生物大分子物质 二、凝胶过滤层析 (gel filtration chromatography) 凝胶的种类： 琼脂糖凝胶 (Sepharose) 交联葡聚糖凝胶 (Sephadex) 聚丙烯酰胺基葡聚糖凝胶(Sephacryl) 样品的准备 凝胶的选择与处理 装柱（L:W=50-100:1） 柱填充的检测 上样（1%-5%) 洗脱 目的蛋白的鉴定与回收 层析柱再生与储存 操作要点： 凝胶过滤层析的应用： 脱盐 蛋白质分离 相对分子质量测定 凝胶过滤 原理： 利用生物大分子与其特异性配基的专一性识别和可逆性结合而建立起来的分离方法 三、亲和层析 (affinity chromatography) 改变大分子物质与配体之间的亲和力 改变pH梯度 ? 洗脱： 亲和层析 四、其它层析技术 高效液相层析 (HPLC) 疏水作用层析 (hydrophobic interaction chromatography) 反相层析 (reversed phase chromatography) 第四节 蛋白质的电泳分析 一、定义(electrophoresis) 带电质点或颗粒在电场作用下向着与其电性相反的方向运动 需要说明以下几点： 带电质点可以是带电的胶体颗粒、离子、甚至一些 非极性的物质，只要其颗粒在胶体大小范围，在电 场中也能向其相反方向运动 带电质点的净电荷与迁移率有关，带电性质决定其 运动方向 生物体内的小分子，氨基酸、多肽、嘌呤、嘧啶 及超过小分子的病毒、细胞器在电场中都能向与 其电性相反的方向运动 三、电泳的分类 在溶液中进行的没有支持介质的电泳，也称移动界面电泳(moving boundary electrophoresis) 自由电泳 (free electrophoresis) 区带电泳 (zone electrophoresis) 将应用支持介质的电泳称为区带电泳 另一涵义：它表示在一个电场的作用下，在某一种支持介质上，能将一种混合物分离成若干条区带(若干组分)的电泳过程 是带电的物质，都可采用某种电泳技术，分离成 不同位置的区带，对区带可进行定性或定量分析 样品用量少 设备简单 可在室温进行 操作简便，消耗时间不多 不同类型的