人骨髓间充质干胞与新生大鼠心肌细胞体外三维条件共培养的实验研究.pdfVIP

人骨髓间充质干细胞与新生大鼠心肌细胞体外三维条 件共培养的实验研究 硕士研究生：乔悦 指导教师：朱宁 教授 专业名称：内科学 摘 要 目的：心脏疾病的发病率和死亡率在各类疾病中始终处于重要地 位，严重威胁人类生存和生活质量。由于成熟的心肌细胞受损后再生 能力十分有限，因此，如何对受损心肌进行有效的修复治疗一直是医学 缺血性心脏病的一个颞途径，即用细胞移植或组织工程的方法，将种子 细胞直接移植或在体外培养成心肌组织后移植到受损的心肌中，用以 修复受损心肌组织。 以往的研究中，种子细胞的来源主要是新生大鼠 心室肌细胞，但是，就临床应用而言，心肌细胞的来源极为有限，并 且来源于异种的心肌细胞在移植过程中也不可避免地要受到免疫排斥 反应的影响，因此，寻求其它来源的种子细胞也就成了目前亟待解决 stem cells，MSCs)，已经被 的问题。骨髓间充质干细胞(Mesenchyrnal 证实在一定的条件下可以转化为心肌细胞，并且因其具有取材容易、体 外扩增能力强等优点，近年来受到了广泛的关注。本研究采用组织工 程三维构建方法，将成人骨髓来源骨髓间充质干细胞(hMSCs)与新生大 鼠心肌细胞在体外三维条件下共培养，探讨心肌细胞形成的心肌微环 境对于人骨髓间充质干细胞向具有心肌细胞表型的细胞分化的影响。 材料与方法： 1．经过反复实践，摸索出相对简便有效、实用的人骨髓间充质干 细胞体外收集、分离、扩增培养技术 2．新生大鼠心肌细胞的原代分离培养：经过反复实践，摸索出相 对简便有效、实用的新生大鼠原代心肌细胞体外收集、分离、培养技 术，得到纯度和存活率都相对较高的原代心肌细胞。 3。采用组织工程三维构建方法，将成人骨髓来源骨髓间充质干细 胞(hMSCs)与新生大鼠心肌细胞在体外三维条件下共培养，探讨心肌细 胞形成的心肌微环境对于人骨髓间充质于细胞向具有心肌细胞表型的 细胞分化的影响。 将分离并培养的新生大鼠心肌细胞与DIPI标记的 bMSCs以及液态I型胶原混合，在环形槽中铸成环状细胞／胶原条带。构 建的条带在环形槽中培养14 d后取出通过光学显微镜、荧光显微镜、 免疫组织化学染色和激光共聚焦显微镜观察，对其中DAPI标记的 hMSCs进行表型分析。 结果：骨髓液密度梯度离心得到人骨髓间充质干细胞，所得细胞 经流式细胞仪检测细胞表面抗原CD34(一)，CD45(一)，CD29(+)， 不是单一的，具有间质细胞、上皮细胞等细胞的特征，但不表达造血 干／祖细胞的标志如CD34和CD45，因此证明我们所分离细胞是不同于 造血干细胞的一类细胞群。 组织学和免疫组织化学染色研究结果显示，在组织工程化三维构 建物中，DAPI标记的hMSCs分布广泛，呈椭圆形，似心肌细胞核，其排列 方向与构建条带长轴排列方向一致。免疫组化检测标记的胞浆心肌特 异蛋白肌钙蛋白T染色阳性。激光共聚焦显微镜观察显示，条带中标记 的蓝染核hMSCs中具有类似周围心肌细胞的肌动蛋白和辅肌动蛋白的 阳性表达：细胞的连接蛋白Connexin43也呈阳性表达。 结论：hMSCs在组织工程化心肌微环境的作用下可以向具有心肌细 胞表型的细胞分化，并且可以和周围的细胞建立细胞连接。hMSCs可以 成为组织工程化心肌的另一种新型的种子细胞来源。在心肌细胞来源 极为有限的情况下，我们可以考虑利用患者自身的hMSCs来部分、甚 ·2· 至全部替代心肌细胞来作为种子细胞构建组织工程化心肌组织，以修 复受损心肌。进而具有广阔的l临床应用前景。 关键词： 问充质干细胞 心肌细胞 共培养 分化 组织工程 ·3· of three-dimensionalcoculture Expe