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第八章 酶的最新进展 1. 核酶 2. 模拟酶 3. 抗体酶 4. 组合生物催化 第一节 核酶 核酶指一类具有催化功能的核酸。 核酶的发现打破了酶是蛋白质的传统概念 早期发现的核酶都是RNA酶。 1981年美国罗拉多大学Cech等发现四膜虫rRNA中I型内含子具有自我剪接功能，1983年Atlman等发现单独RNA可催化tRNA前体为成熟tRNA，具有RNase P活性。 核酶的发现获得1989年诺贝尔奖。 已发现RNA核酶有几十种，其中的植物病毒、拟病毒、卫星RNA均以RNA为模板，以滚动的方式复制RNA，自我切割是其RNA生命周期不可缺少的一环。 一、核酶的结构及催化机理 1、剪切型核酶的结构及催化机理 （1）锤头状酶 典型二级结构： 催化部分 底物部分 循环剪切过程： 底物和核酶结合， 剪切反应发生， 产物释放， 核酶进入下一次催化过程。 （2）发夹状核酶 最初在烟草斑点病毒的卫星RNA中发现。其具有可逆的自切割反应活性，使滚环复制的产物最终形成成熟的病毒核酸。 由于改变螺旋结构中的某些核苷酸序列并不影响核酶的催化功能，这一特性使人们可以人工设计发夹状核酶，特异性切割目的基因，从而达到使基因沉默的目的。 发夹状酶还具有：催化反应过程不需要金属离子的直接参与，推测在发夹状核酶介导的催化反应中，金属离子多行使的是稳定结构的作用，而且pH值变动对发夹状核酶催化反应的影响小。 （3）肝炎δ病毒核酶 肝炎δ病毒（HDV）核酶来源于肝炎δ病毒的基因组RNA和反义基因组RNA。肝炎δ病毒的基因组为单股环状负链RNA病毒，通过滚环机制进行复制，产生的多聚体RNA链经过自我位点特异性的切割和连接形成子代共价闭合环状分子。 （4）VS核酶 VS核酶来源于某种脉胞菌菌株的线粒体。 球状核酶，由5个双螺旋组成了两部分螺旋区。 通用的催化机理 （二）剪接型核酶的结构及催化机理 剪接型核酶的作用机制是通过既剪又接的方式除去内含子。 （1）I型内含子的自我剪接 L19是最早发现的I型内含子，特征： 拼接点序列为5U…..G3‘ 中部核心结构 内部引导序列 剪接通过转酯反应进行 Ⅰ型内含子所催化的典型反应是包括两步磷酸酯键转移反应的RNA剪接反应。 另外带有I型内含子的前体ＲＮＡ在3‘剪接位点上海特别容易发生特异性自发水解，水解反应无需外源G的参与。 （2）Ⅱ型内含子的自我剪接 在真菌、原核生物、植物的rRNA、tRNA、mRNA中已发现了100多种，其代表分子式酵母线粒体细胞色素氧化酶mRNA前体。 Ⅱ型内含子结构有3部分组成：边界序列5‘GUGCG…..YANAG,3’茎环结构以及分支点序列组成。 剪接机制与I型内含子的剪接机制类似，不过它无需鸟苷的辅助，但需镁离子的存在。 （3）RNAase P核酶 由RNA和蛋白质构成的复合体。 RNA组分是真正的活性中心，其成分高度保守。 核酸内切酶，参与所有原核tRNA初始转录产物5‘末端的加工成熟过程。 前体tRNA在tRNA剪切酶的作用下，被切成一定大小的tRNA 分子。 二、脱氧核酶 脱氧核酶是指具有催化功能的ＤＮＡ分子。脱氧核酶一般的获得方法是体外选择。 先合成一个随机的多核苷酸单链DNA库，其中每一条链的两端的序列式固定队，以此随机单链库为模板，进行PCR扩增，而且引物的5’端还包含有一个生物素基团，用于以后的亲和柱分离。在一定的反应条件下使PCR扩增产物进行自我裂解，若有切割反应发生，被切割的分子即被洗脱下来，从而完成第一轮筛选。再经PCR进行下一轮选择，经过多次筛选即可产生具有催化功能的分子。再将产物克隆、测序，就可得到具有自我裂解活性的DNA分子序列。 1、具有水解酶活性的脱氧核酶 以RNA为底物的脱氧核酶最典型的为10-23DRz，包括底物结合臂和催化序列两部分。 2、具有N-糖基化酶活性的DRz 专一性水解嘌呤碱基的N-糖苷键，促使脱氧胞嘧啶的N-糖苷键发生水解反应，导致DNA链在腺嘌呤位点处被切断，产生一个脱嘌呤位点（AP位点），使该位点DNA的遗传信息片段丢失。 3、具有连接酶活性的DRz 催化与它互补的两个DNA片段之间形成磷酸二酯键连接成一个DNA分子。 三、核酶的应用和最新进展 核酶和脱氧核酶与反义药物不同，它们具有催化活性，即一个核酸分子可裂解多个靶RNA分子，能够避免反义ＲＮＡ在活性浓度低时的诸多毒副作用，加之核酸不编码蛋白质而不产生免疫原性，在应用上具有更大的潜力。 1、在抗病毒方面的研究 ＨＩＶ是一种逆转录病毒，是核酶应用研究的理想靶标。 2、针对肿瘤基因的研究 核酸用于肿瘤治疗主要机制是裂解癌细胞。 3、靶标识别 反向基因组策略。 4、其他方面的研究 核酸可作为生物传感器分子在分子水平快