野生型p53基治疗涎腺腺样囊性癌的实验研究.pdf

中文 摘 要 野生型p53基因治疗涎腺腺样囊性癌的实验研究 摘 要 目的:涎腺腺样囊性癌(salivaryadenoidcysticcarcinoma,SACC)是较 为常见的涎腺恶性肿瘤之一。由于其侵袭性广，尤其是嗜神经并沿其逐渐 扩散，易血行转移，术后易于复发。该肿瘤对放疗、化疗不敏感，所以远 期疗效不佳。为了探讨p53基因在临床治疗涎腺腺样囊性癌的可行性，本 实验以涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83为对象观察了腺病毒载体介导的外 源性野生型p53基因对其端粒酶活性及转录调节的影响以及对SACC-83细 胞生物学特性的作用;检测SACC-83细胞中DNApolp启动子的活性;并 对不同启动子调控的p53基因表达的变化和p53基因在引起DNA损伤的各 种刺激因素下的反应做初步的探讨，旨在为开展体内涎腺腺样囊性癌的 p53基因治疗提供新的途径及理论依据。 方法:将外源性野生型p53基因片段 ((1.8kb)重组于腺病毒表达载体 pAEl构建真核表达载体pAE1-p53;以TfXTM-20脂质体法瞬时转染涎腺腺样 囊性癌细胞SACC-83，并以转染空载体pAEl及未转染细胞为对照。 RT-PCR检测外源性野生型p53基因mRNA的表达，TRAP-PCR-ELISA法 (端粒重复序列扩增法一酶联免疫试验)定量分析转染涎腺腺样囊性癌细 胞SACC-83端粒酶活性的变化情况;构建含有端粒酶逆转录催化亚单位 hTERT启动子核心调控区一586bp-+35bp片段 (630bp)的荧光素酶报告 重组体pGL2-630，将pAEI-p53,pGL2-630瞬时共转染SACC-83细胞，转 染中以p一半乳糖普酶表达质粒做共转染，以便校正转染效率，48h后收 获细胞，液体闪烁计数仪检测荧光素酶报告基因活性，酶标仪分析R-gal 活性，计算荧光素酶活性与p-gal活性的比值，得到相对荧光素酶活性，分 析外源性p53基因表达对hTERT转录调节的直接作用。 脂质体法将外源性野生型p53基因稳定转染涎腺腺样囊性癌细胞 SACC-83，以稳定转染空载体pAE1的SACC-83细胞及未转染的SACC-83 细胞为对照。400ugml-G418筛选4周，挑选稳定单个克隆并逐步扩 大培养:同样RT-PCR检测外源性野生型p53基因的表达以及p53基因对 碟扮醉描拱帚催秋而鱼VXhTERTmRNA夫伏的影响:流式细胸术分析 中文 摘 要 外源性野生型p53基因转染对SACC-83细胞周期的影响;软琼脂集落形 成实验采用双层软琼脂培养法，观察外源性野生型p53基因表达对 SACC-83细胞的非锚定依赖性生长特性的抑制情况，从而进一步推断 细胞恶性程度的改变;裸鼠成瘤试验将BALB/c裸鼠随机分成3组，每 组5只，每只裸鼠右侧背部皮下注射细胞悬液 (1x1护个细胞)，其中 一组为实验组，注射pAEl-p53转染的SACC-83细胞悬液，另外两组做 为对照组，分别注射空载体pAE1转染的SACC-83细胞悬液和未转染的 SACC-83细胞悬液，观察裸鼠肿瘤生长情况，30天后取移植瘤组织称 重和测量肿瘤长、短径，肿瘤体积二(4/3)二x(长度/2) (宽度/2) (长度+宽度)/4，计算移植瘤体积及成瘤率。移植瘤组织常规固定、包 埋，制作病理切片，HE染色观察组织学变化及病理诊断，观察外源性野 生型p53基因转染对SACC-83细胞生物学特性的影响。数据均用X1s，采 用t检验进行显著性分析。 携带DNApolp启动子片段的荧光素酶报告基因载体pGL2-B瞬时转染 涎腺腺样囊性癌细胞SACC-83，通过荧光素酶的测定来观察DNApolp启 动子的活性。构建不同启动子调控下的p53基因真核表达载体pcDNA3-p53 (含CMV启动子)、pcDNA3-p53-B(含DNA聚合酶p(DNApolymerasep， DNApolo)启动子)，采用相同的TfXTM-20脂质体法分别稳定转染空载 体pcDNA3,pcDNA3-p53,pcDNA3-p53-B入涎腺腺样囊性癌细胞 SACC-83，并经4001gmlG418筛选，获得稳定单个克隆;RT-PCR 对细胞克隆进行鉴定，凝胶成像系统分析不同启动子调