鱼类哈维氏弧菌致病性及疫苗的研究.pdfVIP

摘 要 鱼类哈维氏弧菌的致病性及疫苗的研究 摘 要 哈维氏弧菌（Vibrio harveyi）是引起鱼类细菌性病害的一类重要的病原菌。本文从广东阳 江患病的红鳍笛鲷肝脏分离到一株致病菌 SpGY020601，针对其致病性和疫苗进行了研究。 对该菌进行常规的生理生化鉴定和热激蛋白 HSP60 基因序列比较鉴定，确认该菌为哈维氏 弧菌。用该菌腹腔注射感染斜带石斑鱼、鲫鱼和小鼠，并和其他两株哈维氏弧菌的毒性作了比 较，发现三株菌都有比较强的毒力。用 Reed －Muench 法计算该菌对鲫鱼的 LD50 为 2.1 × 5 6 10 CFU/g 鱼体重，对斜带石斑鱼的 LD50 为 4.7 ×10 CFU/g 鱼体重。 毒性试验表明该菌的胞外产物具有很强的毒力，对鲫鱼的 LD50 为 3.3µg 蛋白/g 鱼体重，具 有淀粉酶、明胶酶、脂肪酶活性，对小鼠、鲫鱼、斜带石斑鱼、O 型人血的红细胞的溶血性都 较弱，对草鱼的吻端成纤维细胞（PSF ）具有细胞毒性，在pH8.0 ，50℃时具有最高的蛋白酶活 性，不能被丝氨酸蛋白酶抑制剂苯甲基磺酰氟（PMSF ），金属蛋白酶抑制剂EDTA 抑制，金属 2+ 2+ 2+ TM TM 离子 Ca 、Zn 、Mg 都能增强蛋白酶的活性。经 HiPerp 16/60 Sephacryi S-200 （1.6×60cm） 聚丙烯酰胺葡聚胶柱层析、HiPerp®16/10 Q XL （1.6×10cm）阴离子柱层析对ECP 进行了纯化， 收集有蛋白酶活性的部分。SDS分析，得到分子量为 38kDa 的主要蛋白带，该蛋白对鲫 鱼有致死毒性。 同时对 SpGY020601 等 7 株哈维氏弧菌，以及 1 株溶藻弧菌、1 株创伤弧菌的 LPS 和 OMP 的抗原性进行了比较。SDS图谱表明，哈维氏弧菌的 OMP 蛋白条带差异较大，但都有 共同的一条 36kDa 蛋白带。LPS 的电泳图谱比较相似，都有 34kDa 和 20kDa 的共同 O 侧链主 带。OMP 的免疫印迹试验结果显示，除了溶藻弧菌，其他菌株在 36kDa 处都有共同的免疫反 应条带，部分菌株在 17kDa 处也有免疫反应条带。而 LPS 的免疫印迹结果表明，SpGY020601 株的抗血清只与本身菌株的 LPS 有免疫反应，基本不与其他菌株发生免疫反应。说明 LPS 和 OMP 都有很强的抗原性，哈维氏弧菌的 OMP 有共同的抗原条带，可以对不同菌株形成交叉免 疫保护。 提取哈维氏弧菌 SpGY020601 的ECP、LPS 成分，分别制成各种疫苗，进行了浸泡和注射 两种途径免疫鲫鱼，并在浸泡免疫组中 LPS 和 ECP 苗另外加入莨宕碱、左旋咪唑和β-1,3 葡聚 糖作为佐剂。结果表明：各种疫苗都能有效的刺激鲫鱼产生特异性抗体，大部分组在第二、三 周达到高峰，到第四周抗体效价开始下降，注射组抗体水平明显高于浸泡组，对照组没有检测 到抗体。注射组中，LPS 组的保护力最高，ECP 最差。浸泡免疫组中，LPS+莨菪碱组最高保护 力，HKC 组和 LPS ＋左旋咪唑组保护力最低。从鲫鱼的免疫试验中挑选免疫效果相对比较好的 组来免疫斜带石斑鱼，接种途径同上，每组中取部分鱼进行二次免疫，在第 0 周、第 4 周和第 8 周测量了鱼体的重量，观察疫苗对试验鱼生长的影响。试验表明二次免疫能有效的激活免疫 i 摘 要 记忆，增强抗体效价；大部分免疫组都能促进鱼体的生长。浸泡组中，LPS ＋葡聚糖组取得最 好的免疫保护。虽然注射组免疫保护力比浸泡组高，但在实际生产中不实用，而浸泡的最好免 疫保护力能达到 66.7 ％，对于昂贵的养殖石斑鱼这是非常有实用价值的。从哈维氏弧菌疫苗对 鲫鱼和斜带石斑鱼的免疫试验表明，各种疫苗的免疫效果在两种试验鱼中得到比较好的一致性， 说明用鲫鱼代替海水鱼初步筛选弧菌疫苗有一定的可行性。 关键词：哈维氏弧菌，致病性，